دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت
دانشکده علوم پایه
گروه آموزشی میکروبیولوژی
پایاننامه تحصیلی جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد رشته:زیست شناسی سلولی و مولکولی گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
بررسی تنوع ژن Coa در استافیلوکوکوس اورئوس های جدا شده از نمونه های بالینی در رشت

استاد راهنما:
دکتر لیلا اسد پور
استاد مشاور:
دکتر……………………………
نگارش:
محمد رضا ایزدپناه
نیمسال تحصیلی
94-93
چکیده
استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل بیماریزای متداول در انسان و دام است که طیف وسیعی از بیماریها را ایجاد میکند و آنزیم کوآگولاز از عوامل مهم بیماریزای این باکتری می باشد. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی ژن کد کننده این آنزیم (coa) یکی از روش های مولکولی تعیین تیپ جدایه های استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. در این مطالعه 30 جدایه بالینی استافیلوکوس اورئوس جدا شده از نمونه های مختلف مثل ادرار، پوست و خون در رشت مورد استفاده قرار گرفت. برای تعیین تیپ کوآگولاز منطقه بسیار متغیر ژن این آنزیم در واکنش PCR تکثیر وسپس مورد هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم اندونوکلئاز محدودگر AluI قرار گرفت و تنوع طول قطعات هضم آنزیمی مورد بررسی قرار گرفت. در مجموع در واکنش PCR دو نوع محصول ( به طول های 680 و 750 جفت باز) و شش الگوی مختلف RFLP (280+400, 280+470،340+340 و عدم هضم قطعه 750 جفت بازی) بدست آمد. نتایج بیانگر تنوع ژن کوآگولاز در جدایه های استافیلوکوکوس اورئوس در منطقه می باشد و الگوی PCR-RFLP 280+400 جفت بازی الگوی غالب بوده است

فصل اول
کلیات تحقیق

1-1- مقدمه
استافیلوکوک تنها جنس در خانواده میکروکوکاسیه می باشد که اهمیت پزشکی دارد. استافیلوکوک ها، کوکسی های گرم مثبت و بی هوازی اختیاری هستند که با آرایش خوشه انگوری رشد می کنند. نام استافیلوکوک از ریشه یونانی استافیل(به معنای یک خوشه انگور) و کوکوس(به معنای یک دانه یا حبه) گرفته شده است. برای اولین بار این واژه در توصیف ارگانیسم هایی استفاده شده که در ترشحات چرکی زخم های جراحی وجود داشته اند.
استافیلوکوک ها در همه جا یافت می شوند. آنها رایج ترین ارگانیسم ها در پزشکی هستند. علی رغم عرضه عوامل ضد میکروبی و بهبودی بهداشت( که نقش موثری در کاهش شیوع و مرگ و میر بیماری های استافیلوکوکی در قرن بیستم داشته است) هنوز استافیلوکوک ها به عنوان بیماری زاهای مهم بیمارستانی باقی مانده اند. آنها مسئول بیش از 80% از بیماری های چرکی می باشند که در بالین بیمار یافت می شوند و بعد از اشرشیا کلی، دومین علت عفونت های بیماران بستری در بیمارستان را به خود اختصاص می دهند. جایگاه طبیعی اولیه استافیلوکوک ها، سطح بدن پستانداران می باشد که در آن ارگانیسم ها به تعداد زیادی یافت می شوند. در تطابق با زندگی انگلی، استافیلوکوک ها با استعداد ترین و موفق ترین باکتری های بیماری زا هستند. اگر سد دفاعی بدن میزبان به علت جراحت و یا جراحی، آسیب ببیند و ارگانیسم ها در بافت زمینه ای نفوذ کنند قدرت تهاجمی نهفته آنها آشکار خواهد شد. از هنگامی که جریان خون مورد تهاجم قرار می گیرد استافیلوکوک ها می توانند اندوکاردیت حاد و ضایعات متاستیک منتشر را ایجاد کنند. فاکتور عمده ای که موجب شده است تا اینکه علی رغم عرضه بسیاری از آنتی بیوتیک های ضد استافیلوکوکی (در مدت 40 سال گذشته) باز هم ارگانیسم ها بقای خود را حفظ کنند این ویژگی مربوط به توانایی آنها در مقاوم شدن در برابر عوامل ضد میکروبی است. سوش های مقاوم در برابر پنی سیلین(و مشتقات آن) و همراهی این سوش ها با درگیری های اپیدمیک عفونت های شدید بیمارستانی، بیشترین توجه را به خود جلب کرده است از میان 20 گونه استافیلوکوک، فقط 3 گونه از آنها : استافیلوکوک اورئوس، استافیلوکوک اپیدرمیس و استافیلوکوک ساپروفیتیکوس اهمیت بالینی دارند. سوش های جوان برخی از استافیلوکوک ها پیگمان زرد را تولید می کنند. این ارگانیسم ها تحت عنوان استافیلوکوک اورئوس نامیده شدند تا از سوش های با قدرت بیماری زایی کمتر(استافیلوکوک های تولید کننده کلونی سفید) متمایز شوند. تولید پیگمان ویژگی متغیری در استافیلوکوک ها است و ارتباط آن با بیماری زایی قطعی نیست. امروزه توانایی تولید کواگولاز جایگزین نوع پیگمان در کلونی ها شده است. توانایی تولید کواگولاز مفید ترین معیار تشخیص برای استافیلوکوک اورئوس می باشد.اگر چه که استافیلوکوک اورئوس مهمترین بیماری زا برای انسان می باشد، استافیلوکوک های کواگولاز- منفی نیز از عوامل بیماری زا در عفونت های بیمارستانی هستند (10 , 8 ) استافیلوکوکوس اورئوس یکی از پاتوژن های مهم و دومین عامل شایع در عفونت های بیمارستانی می باشد که مسئول عفونت های سطحی پوست تا بسیاری از عفونت های جدی نظیر سپتی سمی ، اندوکاردیت و استئومیلیت در افراد بستری در بیمارستان ها و از عوامل شایع مرگ و میر در بیماران تحت همودیالیز می باشد(7 , 8 , 10 ).
تصویر1-1- تصاویر سمت راست وچپ به ترتیب توسط میکروسکوپ های نوری و الکترونی از باکتری استافیلوکوک اورئوس گرفته شده است

1-2- بیان مساله
از آنجا که مقاومت نسبت به داروهای ضد میکروبی در حال گسترش است و استافیلوکوکوس اورئوس بیش از اکثر باکتریهای دیگر مقاومت دارویی نشان می دهد مکانیسم های دفاعی سیستم ایمنی به عنوان استراتژی ضد میکروبی این باکتری بسیار مورد توجه می باشد. از طرفی استافیلوکوکوس اورئوس به روش های مختلفی در برابر مکانیسم های دفاعی بدن مقاومت کرده یا از آن می گریزد. تولید آنزیم کوآگولاز توسط استافیلوکوکوس اورئوس بسیار مورد توجه میکروب شناسان بالینی بوده به عنوان یک شاخص مهم در شناسایی این باکتری به حساب می آید. آنزیم کوآگولاز در استافیلوکوک اورئوس یک آنزیم خارج سلولی می باشد که عملکرد ی همانند عمل تبدیل فیبرینوژن به فیبرین دارد که توسط ترومبین کاتالیز می گردد. کواگولاز-ترومبین نه تنها موجب انعقاد فیبرینوژن می گردد بلکه موجب فعالیت پروتئولیتیک و استرئولیتیک نیز می گردد. کواگولاز با ایجاد سدی از فیبرین در دور محل ضایعه، استافیلوکوک را در مقابل فاگوسیتوز به وسیله گلبول های سفید محافظت می کند(8). ژن coa که پروتئین کوآگولاز را کد می کند به علت داشتن توالی های متغیر در ناحیه کدکننده ´3 بسیار پلی مورف است و می تواند در متمایز کردن جدایه های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. ناحیه متغیر ژن coa از توالی های تکراری 81 جفت بازی تشکیل شده است که تعداد تکرار این توالی ها در سویه های مختلف استافیلوکوکوس اورئوس متغیر است(44,101 ).در بسیاری از کشور ها تعیین ژنوتیپ استافیلوکوکوس اورئوس بخشی از برنامه های سیستم های نظارتی بوده ابزار مهمی در مطالعه منشاء سویه ها ،تعیین ارتباط کلون ها و اپیدمیولوژی موارد شیوع است. مولکولار تایپینگ نقش اساسی در مطالعات اپیدمیولوژیک عفونت های فرصت طلب ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس دارد. کاراترین روش تایپینگ مولکولی Pulsed Field gel Electrophoresis می باشد که تکنیک پیچیده، گران و وقت گیری است. به همین دلیل تلاش هایی در جهت دست یابی به تکنیک های ساده ، سریع و ارزان انجام پذیرفت. مطالعات مختلف نشان داد تکثیر مناطق ژنی بسیار متغیر و آنالیز هضم آنزیمی محصول (PCR-RFLP) یکی از روش های کارا در تایپینگ مولکولی استافیلوکوکوس اورئوس می باشد. در پژوهش حاضر 30 جدایه استافیلوکوکوس اورئوس از نظر پلی مورفیسم در ژن coa بررسی ، وجود و عدم وجود ارتباط معنی دار بین ژنوتیپ coa و نوع عفونت بالینی ( موضعی یا سیستمیک بودن آن ) بررسی می گردد.
تصویر 1-2- مکانیسم تبدیل فیبرینوژن به فیبرین
1-3- اهمیت و ضرورت
شیوع گسترده و اهمیت بهداشتی عفونت های ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس سبب شد در سراسر دنیا، تحقیقات گسترده در مورد ژن های موثر در پاتوژنز و شناسایی بیوتیپ ها و ژنوتیپ های مختلف این باکتری انجام گیرد. کوآگولاز به عنوان مهم ترین عامل پاتوژنز در استافیلوکوکوس شناخته شده است( 8 ). با توجه به اهمیت استافیلوکوکوس اورئوس در عفونت های بیمارستانی ، آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی این باکتریها در منطقه در برنامه های کنترل ، پیشگیری ، درمان و پیش آگهی از پیامد عفونت حایز اهمیت می باشد(8 , 7).
1-4- اهداف پژوهش
هدف از این تحقیق بررسی الگوهای ژنتیکی آنزیم کواگولاز استافیلوکوک اورئوس جدا شده از نمونه های بالینی و همچنین بررسی رابطه بین الگوی ژنتیکی آنزیم کواگولاز و نوع عفونت بالینی ناشی از این باکتری می باشد.
1-5- استافیلوکوک اورئوس
استافیلوکوک اورئوس یک کوکسی فاقد تحرک با قطر تقریبی 8/0 تا 1/0 میکرون می باشدکه در سه محور تقسیم شده و تجمعات نا منظم از سلول هایی شبیه به خوشه انگور را به وجود می آورد. در اسمیرهای برداشت شده از کشت که در محیط های جامد رشد کرده باشند باکتری ها در شکل تجمعات خوشه انگوری و نا منظم هستند اما در کشت های آبگوشت ترجیحاً زنجیره های کوتاه و فرم های دیپلوکوک، رایج تر می باشند. تعداد معدودی از سوش ها کپسول و یا لابه لعابی تولید می کنندکه قدرت بیماری زایی ارگانیسم را فزایش می دهد. استافیلوکوک اورئوس یک ارگانیسم گرم مثبت میباشد اما سلول های کهنه و ارگانیسم های فاگوسیتوز شده به صورت گرم منفی دیده می شوند(7 , 8 , 10).
1-6- جزئیات ساختمانی وتشکیلات سلول
ساختار زیربنایی استافیلوکوک مشابه با بقیه ارگانیسم های گرم مثبت می باشد. در مقاطع نازکی که از سلول های مرحله لگاریتمی برداشته شده باشد نوکلئوئید، مزوزوم و یک غشای سیتوپلاسمی سه ردیفی آشکار می شود که به وسیله ناحیه پری پلاسمی از دیواره سلول متمایز می گردد. در سوش های کپسول دار، یک لایه فیمبریه شکل و یا یک لایه کپسولی نیز ممکن است دیده شود. دیواره سلولی استافیلوکوک اورئوس مشتمل بر سه جزء اصلی: پپتیدوگلیکان، اسیدتیکوئیک و پروتئین A می باشد. محتوای اصلی این اجزاء دیواره سلولی در متمایز کردن استافیلوکوک از میکروکوک و استافیلوکوک اورئوس از استافیلوکوک اپیدرمیس مفید است. پپتیدوگلیکان در حدود 40 تا 60 درصد از وزن دیواره سلولی را به خود اختصاص می دهد.مقادیر بقیه اجزای دیواره سلولی متغییر است (7 , 8 ).
1-6-1- پپتیدوگلیکان
در استافیلوکوک ساختمان اولیه پپتیدوگلیکان از ابزارهای متمایز کننده گونه ها می باشد. مانند آنچه در اغلب باکتری ها دیده می شود بخش گلیکان حاوی واحد های تکراری ان-استیل گلوکز آمین و ان-استیل مورامیک اسید است که به وسیله پیوند های β-1و4- گلیکوزیدی به یکدیگر اتصال یافته اند . در استافیلوکوک ها، تمامی واحد های ان – استیل مورامیک اسید زنجیره های تتراپپتیدی را حمل می کنند که به توسط پل های پنتاگلایسین به زنجیره تتراپپتیدی از رشته پپتیدوگلیکان مجاور، اتصال می یابند. این پل های عرضی موجب استحکام دیواره سلولی استافیلوکوک شده و به بقای ارگانیسم در بافت های میزبان کمک می کند (20, 51, 71 ).
تصویر1-3- ساختار پپتیدوگلیکان در استافیلوکوکوس اورئوس
1-6-2- اسید تیکوئیک
در استافیلوکوک اورئوس، اسید تیکوئیک دیواره باکتری از نوع ریبیتول فسفات می باشد. اسید تیکوئیک ، یک جزء اصلی گیرنده فاژ در استافیلوکوک اورئوس می باشد. علاوه بر این، اسید تیکوئیک نقش مهمی را در نگهداری عملکرد طبیعی فیزیولوژیک بر عهده دارد(118). اسید تیکوئیک به توسط تنظیم محیط کاتیونی سلول باکتری، فعالیت آنزیم های اتولیتیک(که در رشد دیواره سلولی و جدا شدن سلول های دختری شرکت دارند) را کنترل می کند. موتانت هایی وجود دارند که به طور کامل فاقد اسید تیکوئیک می باشند. در مطالعاتی که بر روی این موتانت ها انجام گرفته نشان داده شده است که پلیمر اسید تیکوئیک برای بقاء ارگانیسم، ضروری نیست اما این موتانت هایی که در برابر فاژ مقاوم هستند نسبت به ارگانیسم های نوع وحشی، رشد آهسته تری دارند و سلول های بزرگ، جدا نشده و دیواره عرضی غیر طبیعی را ایجاد می کنند(10, 101).
1-6-3- پروتئین A
پروتئین A، جزء پروتئینی عمده در دیواره سلولی استافیلوکوک اورئوس می باشد. در حدود 30 درصد از این پروتئین در جریان رشد سلول در درون محیط آزاد می شود (7). این پروتئین یک آنتی ژن میباشد که برای اغلب سوش های استافیلوکوک اورئوس اختصاصی است و در بقیه استافیلوکوک ها و یا میکروکوک ها وجود ندارد. این پروتئین در سلول باکتری با پیوند کووالانسی به ساختمان پپتیدوگلیکان متصل می شود به طور یکنواخت در تمامی دیواره سلولی توزیع می گردد. خصوصیت منحصر بفرد این پروتئین، توانایی بروز واکنش های غیر اختصاصی با ایمونوگلوبولین هاست(31, 121 , 122).
1-7- فیزیولوژی
1-7-1- صفات کشت
استافیلوکوک، بی هوازی اختیاری است اما در شرایط هوازی رشد بیشتری دارد. بعضی سوش ها به افزایش فشار دی اکسید کربن نیز نیاز دارند. رشد در محدوده درجه حرارت وسیعی از 6.5 درجه سانتی گراد تا 37 درجه می باشد. PH اپتیمم رشد در محدوده 7 تا 7.5 می باشد اما در محدوده 4.2 تا 9.8 نیز رشد می کند. استافیلو کوک ها، نیاز های غذایی پیچیده ای دارند اما به خوبی بر روی اغلب محیط های رایج آزمایشگاهی( از قبیل آگار غذایی و آگار تریپتی کیز سوی) رشد می کنند. برای جدا سازی اولیه آنها( از نمونه های بالینی)، آگار خون گوسفند توصیه می شود. خون انسان حاوی مهار کننده غیر اختصاصی و آنتی بادی است لذا در تهیه آگار خون دار نبایستی مورد استفاده قرار گیرد (7).
در سطح پلیت آگار، کلونی ها اندازهایی در حدود قطر 1 تا 4 میلی متر داشته، صاف، مات، کروی و کمی محدب هستند. در جدا سازی اولیه، اغلب استافیلوکوک اورئوس ها کلونی های زرد طلایی تولید می کنند. رنگ کلونی ها می تواند مربوط به پیگمان های کاروتنوئید باشد که به شدت متغیر بوده و از پرتقالی تیره تا زرد کم رنگ متفاوت است. این تنوع در رنگ کلونی ها معیار با ارزشی برای جدا سازی استافیلوکوک اورئوس از استافیلوکوک اپیدرمیس است. بهترین شرایط برای تولید پیگمان در هنگامی است که ارگانیسم ها برای 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری شده و سپس برای 24 تا 28 ساعت دیگر در دمای اتاق باقی بمانند. در شرایط بی هوازی و یا در محیط های مایع، هیچ پیگمانی تولید نمی شود.ارگانیسم هایی که همولیزین محلول را تولید می کنند( در سطح محیط کشت آگار خون دار) منطقه ای از همولیز بتا رادر اطراف کلونی های خود به وجود می آورند(7 , 8 , 129).
1-7-2- متابولیسم
انرژی در مسیر های تنفسی و تخمیری هر دو به دست می آید. در شرایط مناسب رشد، هر یک از مسیر های گلیکولیز، ار قبیل مسیر پنتوز فسفات و چرخه اسید سیتریک فعال هستند. استافیلوکوک در شرایط پتانسیل اکسیداسیون – احیاء بالا و پایین هر دو، توانایی رشد دارد که مزیت مناسبی برای ارگانیسم می باشد تا اینکه بتواند در مسکن های طبیعی در سطوح مخاطی و در رقابت با بقیه گونه های باکتریال فلور مخلوط میکروبی( در محل عفونت) به رقابت بپردازد ( 34 , 112, 133).
سلول هایی که در شرایط هوازی رشد می کنند آنزیم کاتالاز را تولید می نمایند. در کشت آگار خون دار که در آنها تست کاتالاز انجام می شود بایستی از انتقال گلبول های قرمز(در همراهی با ارگانیسم)اجتناب شود، کاتالاز در سلول های گلبول های قرمز وجود دارد بنابراین، حضور آن در مخلوط باکتری ممکن است عامل بروز واکنش مثبت کاذب شود ( 7 , 8 ).
1-7-3- شناسایی
توانایی تولید آنزیم کواگولاز( آنزیم لخته کننده پلاسما) مناسب ترین و قابل قبول ترین ویژگی در مقاصد تشخیصی است. تقریباً 97 درصد از استافیلوکوک هایی که از نمونه های پاتولوژیک به دست می آیند این آنزیم را آزاد می کنند. در آزمون بررسی تولید کواگولاز، بایستی از تست لوله ای استفاده شود. تست اسلایدی در مقاصد غربالی مفید است و ممولاً نتایج آن به خوبی با تست لوله ای مطابقت دارد. در تست اسلایدی، حضور یک فاکتور توده ای کننده در سطح باکتری ارزیابی می شود که از آنزیم کواگولاز آزاد متمایز می باشد. ارزشمندی تست اسلایدی نسبت به روش لوله ای کمتر است (7).
1-8- طبقه بندی
1-8-1- تعیین تیپ باکتریوفاژ
اغلب سوش های استافیلوکوک اورئوس لیزوژن هستند. آنها فاژهایی را حمل می کنند که خودشان در برابر این فاژها مصون هستند اما می توانند اعضای بقیه گونه ها را لیز کنند. حساس بودن سوش های استافیلوکوک اورئوس در برابر انواعی از فاژهای معتدل می باشد که در مطالعات اپیدمیولوژیک مفید است( 24).
الگوی فاژی سوش های مختلف، اساساً مربوط به سه گروه وسیع از فاژها است و به گروه هایی از فاژها که این سوش ها را به عنوان میزبان انتخاب می کنند اشاره می کند. فاژهای درون هر گروه، با یکدیگر بی ارتباط هستند و خصوصیات مرفولوژیک و سرولوژیک متفاوتی دارند. تعیین گروه سوش ها چندان تصادفی نیست. مثلاً سوش های گروه 2 غالباً همراه عفونت های پوستی(از قبیل زرد زخم و پمفیگوس نوزادی) هستند و تولید انتروتوکسین ترجیحاً منحصر به گروه فاژی 3 می باشد. تیپ های فاژی گروه 3 در حملات عفونت نوزادی و دریافت کننده های جراحی به ویژه از گروه سالمندان و کارکنان بیمارستانی شرکت دارند. سوش هایی که موجب بیماری پوسته ریزی می شوند معمولاً به فاژ گروه 2 تعلق دارند و اغلب آنها فقط توسط فاژ 71 لیز می گردند(17, 53, 70).
فقط استافیلوکوک های کواگولاز مثبت ممکن است با این فاژها تعیین تیپ شوند. برای تعیین تیپ فاژ، هر فاژ اختصاصی که در سوش استافیلوکوک مربوط به خود رشد کرده است از سلول های باکتری(توسط روش سانتریفیوژ و فیلتراسیون)جدا می شود.سپس بعد از رقیق سازی مناسب، یک قطره از سوسپانسیون فاژ را در سطح محیط کشت آگار( که در آن کشت جوانی از ارگانیسم وجود دارد) منتقل می کنند. پلیت محیط کشت در مجاورت هوا خشک شده و به مدت یک شب در دمای 30 درجه سانتی گراد نگهداری می شود. نتایج تعیین تیپ فاژ بر اساس فاژهایی است که موجب لیز شدید شده اند ( 7 , 19).
1-8-2- ژنتیک
انعطاف پذیری شدید استافیلوکوک همواره موجب اشکال در شناسایی یک استافیلوکوک اورئوس شاخص می باشد. اهمیت این انعطاف پذیری(در علم پزشکی) مشخص نشده بود تا اینکه به طور ناگهانی سوش های مقاوم در برابر پنی سیلین و سایر آنتی بیوتیک های دیگر، پا به عرصه وجود گذاشتند. مشکلات عدیده درمانی و اپیدمیولوژی که به توسط این سوش های مقاوم در برابر دارو به وجود آمد لزوم انجام مطالعات ژنتیکی را بر روی استافیلوکوک آشکار نمود(7). این نکته مشخص شده که در استافیلوکوک اورئوس، بیشترین موارد مقاومت در برابر آنتی بیوتیک، وابسته به پلاسمید بوده و ژنتیک استافیلوکوک مشابهت زیر بنایی با ژنتیک اشرشیاکلی دارد (73).
در ارگانیسم های طبیعی در حدود 10 درصد کل DNA طبیعی سلول مربوط به DNA پلاسمید می باشد. از آنجایی که این شاخص های ژنتیکی می توانند به سرعت گسترش یابند لذا سلول هایی که این پلاسمید ها را داشته باشند( نسبت به سلول هایی که فاقد این پلاسمید می باشند) در هنگام تغییر در شرایط محیط، قدرت بقای بیشتری دارند. دو کلاس متمایز از پلاسمید در استافیلوکوک، نشان داده شده است.یک کلاس از این پلاسمیدها، پلاسمید های نسبتاً بزرگی هستند که در اغلب موارد انواعی از شاخص های مقاومت قابل تشخیص را حمل می کنند و به تعداد محدود در سلول وجود دارند. این پلاسمید های بزرگ به خودی خود قابل انتقال نیستند و یا اینکه می توانند فرایند شبه کونژوگاسیون را واسطه گری کنند. کلاس دوم، متشکل از پلاسمید های کوچکی است که هر یک از این پلاسمید ها فقط یک شاخص مقاومت را حمل می کنند و در کپی های متعدد وجود دارند. بهترین مثال در ارتباط با مقاومت با واسطه گری پلاسمید، تولید پنی سیلیناز در استافیلوکوک اورئوس می باشد. بسیاری از سوش ها این توانایی را در پلاسمید های 18 تا 21 مگادالتون حمل می کنند. در اغلب موارد، این پلاسمید ها شاخص های مقاومت در برابر بعضی از فلزات سنگین، مقاومت در برابر اریترومایسین، اسید فوزیدیک و یا امینوگلیکوزید ها را نیز حمل می کنند (65، 43). بعضی از این شاخص ها در استافیلوکوک اورئوس، بخشی از توالی های DNA هستند که در شکل ترانسپوزون در جایگاه های متعدد کروموزومی و یا پلاسمیدی، مکان خود را تغییر می دهند. پلاسمید ها نیز می توانند به طور کامل و پایدار در درون کروموزوم وارد شوند. در استافیلوکوک اورئوس، تعدادی از شاخص های ترانسپوزون توصیف شده اند: ترانسپوزون Tn 551 مشابه با بسیاری از ترانسپوزون های اشرشیاکلی می باشد. این پلاسمید توانایی الحاق در انواعی از جایگاه های کروموزومی و پلاسمیدی را دارد. ترانسپوزون هایی که مقاومت در برابر جنتامایسین را کد می کنند مقاوت در برابر توبرامایسین و کانامایسین را نیز کد می نمایید (7 , 73, 64).
در استافیلوکوک ها ، باکتریوفاژها ارتباط نزدیکی با بیان شدن وانتشار شاخص های مقاومت در برابر آنتی بیوتیک دارند. باکتریوفاژها به توسط ترانسداکشن و یا کونژوگاسیون وابسته به فاژ، انتقال مقاومت در برابر آنتی بیوتیک را واسطه گری می کنند. اغلب نمونه های بالینی استافیلوکوک اورئوس، یک یا چند پروفاژ را حمل می کنند که احتمالاً در داخل کرومزوم باکتری وارد می شوند. از میان تعداد زیادی از فاژهای استافیلوکوک فقط فاژهای مربوط به سرگروه B، قدرت انجام ترانس داکسیون را دارند و می توانند پلاسمید ها را منتقل کنند ( 139 ). در طبیعت، ترانس داکشن به طور فراگیر انجام می شود.تقریباً هر خصوصیتی از باکتری می تواند با فرکانسی در حدود 4-10 تا 10-10 بر حسب واحد تشکیل دهنده پلاک از فاژ منتقل شود.
در میان استافیلوکوک ها، یک مکانیسم کونژوگاسیون نیز(غیر وابسته به باکتریوفاژ) برای انتقال پلاسمید های مقاوم در برابرآمینوگلیکوزید به اثبات رسیده است. این پلاسمیدهای کونژوگاسیونی مقاومت در برابر جنتامایسین به عنوان بخشی از فرایند کونژوگاسیون، توانایی به حرکت در آوردن پلاسمید هایی با مقاومت مشابه غیرکونژوگاسیونی را دارند. این مکانیسم کونژوگاسیونی که در انتقال ژن ها شرکت دارد مکانیسمی برای انباشتگی شاخص های متعدد مقاومت در درون استافیلوکوک ها است که در جریان یک فرایند واحد انتقال به وقوع می پیوندد (7).
بعضی از سوش های استافیلوکوک اورئوس، ژن هایی از پلاسمید را برای تولید باکتریوسین حمل می کنند.از بسیاری از جهات این ژن ها مشابه با فاکتورهای کولیسین زا در باکتری های روده ای هستند. تولید باکتریوسین محدود به سوش های فاژ گروه 2 از استافیلوکوک اورئوس می باشد. استافیلوکوکسین، یک پروتئین مقاوم در برابر حرارت و متمایز از بقیه محصولات خارج سلولی استافیلوکوک اورئوس است که یک محصول اختصاصی فاژ می باشد. استافیلوکوسین طیف اثر وسیعی بر روی باکتری ها دارد و استرپتوکوک های بتاهمولیتیک، پنوموکوک ها، بقیه استافیلوکوک ها، کورینه باکتریوم ها و گونه های جنس باسیلوس را شامل می شود. باکتری های گرم منفی و سوش هایی از استافیلوکوک که استافیلوکوکسین را تولید می کنند در برابر آن مقاوم هستند (14).
اگر چه پلاسمید ها در سنتز تعدادی از فاکتور های بیماری زایی استافیلوکوک شرکت دارند اما نقش واقعی آنها به عنوان ژن های ساختمانی یا تنظیم کننده شناخته نشده است. در ارتباط با توکسین آلفا ژن های مربوط به تولید توکسین بر روی ترانسپوزون هستند. برای سنتز توکسین اکسفولیاتیو ژن های کروموزوم و پلاسمید هر دو شرکت دارند، به ترتیبی که هر یک از آن ها گونه های متمایزی از توکسین را تولید می کنند(7, 132,116).
1-8-3- مقاومت
استافیلوکوک ها نسبت به بسیاری از باکتری های فاقد اسپور در برابر شرایط نامساعد محیط، مقاوم تر هستند. آنها در چرک و یا خلط خشک شده برای چندین هفته و در سطح شیب دار آگار برای چندین ماه زنده باقی می مانند. اغلب سوش ها در برابر حرارت نسبتاً مقاوم می باشند و برای کشته شدن آنها دمایی به میزان 60 درجه سانتی گراد برای 1 ساعت مورد نیاز خواهد بود. علاوه بر این، استافیلوکوک ها نسبت به بسیاری از باکتری های دیگر، مقاومت بیشتری در برابر ضدعفونی کننده های شیمیایی رایج( از قبیل فنل ها و کلرید جیوه ) دارند اما مشابه با بقیه ارگانیسم های گرم مثبت در برابر غلظت هایی از اسید های چرب و رنگ های قلیایی(که اغلب ارگانیسم های گرم منفی را مهار نمی کنند) حساس می باشند (7 , 8 ).
1-9- ساختمان آنتی ژن
پاسخ فاگوسیتی میزبان، یک فاکتور سرنوشت ساز در شروع و پیشرفت عفونت های استافیلوکوکی است. در این فرایند، قدرت تشخیصی و ایمنی میزبان به آنتی ژن های سلولی استافیلوکوک( به ویژه آنتی ژن های سطحی آن) بستگی دارد که شاخص های بزرگی را تشکیل می دهند. ساختمان آنتی ژن استافیلوکوک اورئوس، پیچیده می باشد و از میان 30 آنتی ژن فقط خصوصیات بیولوژیک و شیمیایی تعداد معدودی از آنها به خوبی شناخته شده است (7).
1-9-1- اسید تیکوئیک
اسید تیکوئیک، شاخص آنتی ژنی بزرگ در تمام سوش های استافیلوکوک اورئوس می باشد که یک ریبیتول اسید اختصاصی در دیواره سلولی است. مولکول ان – استیل گلوکز آمین، شاخص سرولوژیک در این پلی ساکارید می باشد. در دیواره سلولی باکتری، اسیدتیکوئیک در شرایط غیر محلول و در همراه با پپتیدوگلیکان است که برای آزاد شدن آن آنزیم های لیتیک مورد نیاز هستند. در استافیلوکوک اپیدرمیس، اسید ریبیتول تیکوئیک یافت نمی شود بلکه به جای ان اسید اسید تیکوئیک گلیسرول وجود دارد (118, 134).
اغلب بالغین، یک واکنش ازدیاد حساسیت جلدی از تیپ فوری را بر ضد اسید تیکوئیک دارند و مقادیر کمی از آنتی بادی های پرسی پی تان در سرم آنها یافت می شود. در مبتلایان به عفونت های اخیر استافیلوکوکی از قبیل آندوکاردیت یا باکتریمی، مقادیر بالایی از آنتی بادی های اسید تیکوئیک تولید می شود اما در باکتریمی موقت استافیلوکوکی، افزایش در آنتی بادی های اسید تیکوئیک، غیر شایع می باشد.
اسید تیکوئیک خارج سلولی، مسئول مصرف شدن سریع اجزای اولیه کمپلمان از C1 تا C2 (در سرم انسان) می باشد.فعال شدن کمپلمان در نتیجه تشکیل شدن کمپلکس ایمنی در میان آنتی ژن و آنتی بادی های IgG اختصاصی انسان است. به این ترتیب، اسید تیکوئیک موجب فعال شدن واکنش های بی نتیجه و عقیم مصرف کننده کمپلمان می شود و استافیلو کوک ها را در برابر اوپسونیزاسیون وابسته به کمپلمان محافظت می کند(7 , 92, 137).
1-9-2- پروتئین A
پروتئین A ، یک آنتی ژن اختصاصی گروه و منحصر به سوش های استافیلوکوک اورئوس می باشد. 90 درصد از این پروتئین در اتصال کووالانسی با پپتیدوگلیکان دیواره سلولی است. در جریان رشد سلول، پروتئین A در محیط کشت نیز آزاد می گردد. این مقدار از پروتئین A که در محیط کشت آزاد می شود در حدود 30 درصد تمام پروتئین A را تشکیل می دهد که توسط ارگانیسم تولید شده است (7). پروتئین A یک زنجیره واحد پلی پپتیدی (به وزن مولکولی 42 کیلو دالتون) می باشد. 4 واحد تیروزین که به طور کامل در سطح سلول باکتری نمایان شده اند مسئول فعالیت بیولوژیک می باشند.
منحصر به فرد بودن پروتئین A مربوط به توانایی آن در واکنش با IgG طبیعی در اغلب گونه های حیوانی است. در درون گونه ها، این واکنش ممکن است محدود به بعضی از زیر گروه های IgG باشد. بر خلاف واکنش اختصاصی آنتی ژن – آنتی بادی، در این واکنش، قطعه Fab ایمونوگلوبولین شرکت نمی کند بلکه قطعه Fc شرکت دارد. در پروتئین A ، 5 ناحیه متفاوت وجود دارد. 4 دومن با همگونی زیاد که به قطعه Fc آنتی بادی متصل می شوند( آنتی بادی های IgG1، IgG2، IgG4 وهمچنین IgM وIgA) دومن پنجم که به دیواره سلولی باکتری اتصال می یابد اما به قطعه Fc آنتی بادی متصل نمی شود (25).
پروتئین A انواعی از اثرات بیولوژیک را موجب می شود. این پروتئین اثرات شیمیو تاکسی ضد کمپلمان و ضد فاگوسیتوزی دارد که واکنش های ازدیاد حساسیتی و آسیب پلاکتی را ایجاد می کند. اثرات میتوژنی دارد و فعالیت کشندگی طبیعی، لنفوسیت های انسان را تقویت می کند. اگر چه ارتباط خوبی در میان تولید پروتئین A و فعالیت کواگولاز وجود دارد اما هیچ ارتباطی در زمینه حضور یا فقدان پروتئین A و خصوصیت بیماری زایی دیده نمی شود ( 46, 96, 131).
تصویر1-4- وجود پروتئین A در سطح دیواره سلولی استافیلوکوک اورئوس و اتصال آنتی بادی IgG از ناحیه FC به این پروتئین
1-9-3- پپتیدوگلیکان
پپتیدوگلیکان استافیلوکوکی، هر دو پاسخ های ایمنی هومورال و سلولار را تحریک می کند. به این ترتیب که تقریباً تمامی اشخاص طبیعی، آنتی بادی هایی را در سرم خود بر ضد پپتیدوگلیکان دارند. این آنتی بادی ها ترجیحاً از کلاس IgG هستند که می توانند از جفت عبور کنند. در عفونت های استافیلوکوک اورئوس( به ویژه در مرحله باکتریمی)، آنتی بادی IgG بر ضد پپتیدوگلیکان افزایش می یابد.
این آنتی بادی ها به لحاظ داشتن قدرت اوپسونیزه کنندگی فواید بالقوه ای دارند. افزایش این آنتی بادی ها ممکن است زمینه ساز ابتلاء به اختلالات کمپلکس ایمنی در بعضی از بیماران باشد.]20, 71, 135[
1-9-4- فاکتورهای توده ای کننده
جزئی از دیواره سلولی استافیلوکوک اورئوس که موجب توده ای شدن استافیلوکوک ها( در حضور پلاسما) می شود تحت عنوان فاکتور تودهای کننده شناخته می شود. این جزء از دیواره سلولی به فیبرینوژن انسان اتصال می یابد و از نظر مکانیسم عملکرد و خصوصیات آنتی ژنی از کواگولاز آزاد متفاوت است.
جزء متصل شونده به فیبرینوژن تقریباً همواره در سوش هایی یافت می شود که کواگولاز خارج سلولی را تولید می کنند.سوش های کپسول دار، یک واکنش توده ای کنندگی منفی را نشان می دهند که احتمالاً به علت پوشیده شدن فاکتور توده ای کننده به توسط پلی ساکارید خارج سلولی می باشد(7).
1-9-5- پلی ساکارید کپسولی
داشتن کپسول ویژگی متغییری در استافیلوکوک اورئوس می باشد. اگر چه فقط تعداد معدودی از سوش ها کپسول مشخص را نشان می دهند اما احتمالاً در بدن موجود زنده، داشتن کپسول، پدیده نادری نیست. بسیاری از سوش هایی که از نمونه های بالینی به دست می آیند( در تست کردن با آنتی سرم اختصاصی) آنتی ژن های پلی ساکاریدی را در سطح سلول نشان می دهند. این آنتی ژن ها قدرت ضد فاگوسیتوز دارند. آنها در واکنش های متقابل در میان کمپلکس اسید تیکوئیک – پپتیدوگلیکان و کمپلمان ( که ترجیحاً در مسیر آلترناتیو فعال شده) مداخله می کنند( 6, 7 , 8).
1-10- عوامل موثر در بیماری زایی
یکی از ویژگی های اساسی انگل موفق توانایی بقاء در یک میزبان حیوانی است. در این ارتباط، استافیلوکوک استثنائاً توانایی تطابقی بالقوه ای دارد. از میان مهمترین آنها توانایی اتصال یافتن به انواعی از پروتئین های حیوانی در ماده پیوندی خارج سلولی و در هم شکستن سد های طبیعی در بافت های میزبان است. استافیلوکوک برای انواعی از پروتئین های ذاتی حیوانی، آنزیم های ئیدرولیتیک دارد. این آنزیم ها که در محیط آزاد می شوند در موفقیت و توانمندی ارگانیسم شرکت می کنند. پروتئازها، لیپازها، استرازها و لیازها از میان آنزیم های مهمتری هستند که استقرار ارگانیسم ها در پوست و غشای مخاطی میزبان را تسهیل می کنند. برای بقاء در بدن انسان یک انگل موفق باید بتواند بر سیستم های دفاعی میزبان غلبه کند. برای مدت زمان بیش از نیم قرن، انواع وسیعی از آنزیم های خارج سلولی، توکسین ها و اجزاء سلولی سوش های بیماری زای استافیلوکوک مورد بررسی قرار گرفته اند اما در حال حاضر، هیچ فاکتور واحدی به عنوان تنها عامل ایجاد کننده بیماری شناخته نشده است. قدرت بیماری زایی استافیلوکوک ها به چندین فاکتور بستگی دارد. هر یک از این فاکتور ها در یک زنجیره کمپلکس از واکنش ها شرکت دارند که عفونت استافیلوکوکی آشکاری را موجب می شوند(7).
1-11- آنتی ژن های سطحی
1-11-1- پلی ساکارید ها
اجزای سطحی استافیلوکوک که قدرت ضد فاگوسیتوز دارند اهمیت زیادی را در استقرار اولیه ارگانیسم ها در میزبان بر عهده دارند. استافیلوکوک های کپسول دار به واسطه داشتن کپسول در برابر تهاجم وابسته به کمپلمان میزبان، محافظت می شوند و به سرعت در بافت های میزبان انتشار می یابند. برای لانه گزینی باکتری ها بایستی فرایند عفونی ادامه یابد. برای این منظور چسبندگی ارگانیسم ها به سطح مخاط یا پوست بدن میزبان، واقعه شروع کننده اصلی است. تولید اگزوپلی ساکارید ممکن است یک فاکتور سرنوشت ساز در موفقیت ارگانیسم برای لانه گزینی در اعضای مصنوعی از قبیل دریچه های قلب و یا کاتتر های داخل وریدی باشد. در محیط طبیعی که سرشار از ارگانیسم های رقیب می باشد تولید گلیکوکالیس موجب تشکیل میکروکلونی های چسبنده ای می شود که به توسط یک لایه بیولوژیک در بر گرفته شده اند نه تنها چسبندگی ارگانیسم ها به سطح اندام های مصنوعی را امکان پذیر می کند بلکه آنها را در برابر آنتی بیوتیک ها و دفاع طبیعی میزبان محافظت می کنند (6, 7, 8, 16).
تصویر1-5- ناحیه a نشان دهنده کپسول پلی ساکاریدی می باشد که باکتری را در بر گرفته است
1-11-2- گیرنده های پروتئینی
در سطح سلول استافیلوکوک، تعدادی از جایگاه های اتصالی اختصاصی برای اتصال به پروتئین های پستانداران وجود دارد. این گیرنده ها، مکانیسم چسبنده ای را برای ارگانیسم فراهم می کنند که به توسط آن، ارگانیسم ها در کانون های عفونی استقرار می یابند. از میان پروتئین های پلاسما که به طور اختصاصی به استافیلوکوک اورئوس متصل می شوند: پروتئین های فیبرونکتین، فیبرینوژن و ایمونوگلوبولین G هستند. علاوه بر این، استافیلوکوک ها به اجزای ماده اتصالی خارج سلولی از قبیل لامینین، کلاژن و فیبرونکتین اتصال می یابند(6 ,7 ,8 ). از میان این ترکیب ها، فیبرونکتین( گلیکوپروتئین انحصاری در زخم ها) مورد مطالعه بیشتری قرار گرفته است. فیبرونکتین، چسبندگی سلول های حیاتی از قبیل فیبروبلاست ها، سلول های اپیتلیال و مونوسیت ها به جایگاه آسیب دیده را واسطه گری می کند. استافیلوکوک اورئوس به طور اختصاصی به بافت میزبان متصل می شود. در این اتصال، فیبرونکتین به عنوان پلی در میان ارگانیسم و بافت آسیب دیده میزبان عمل می کند(95, 105). لامینین پروتئین دیگری در پستانداران است که استافیلوکوک اورئوس برای آن گیرنده دارد. این پروتئین، عمده ترین گلیکو پروتئین در غشای پایه در انسان است (76, 140 ) توانایی بالقوه شبه متاستازی استافیلوکوک( که در جهت شکستن سد های دفاعی طبیعی است) احتمالاً در ارتباط با توانایی آن در برقراری پیوند اختصاصی با غشاهای پایه می باشد. پروتئین های متعددی در پستانداران وجود دارند که می توانند به طور اختصاصی به استافیلوکوک اورئوس اتصال یابند. این مسئله، پیشنهاد کننده این مطلب می باشد که بیش از یک ژن چسبنده وجود دارد. حداقل یکی از این ژن ها، بر روی پلاسمید قرار گرفته است. اگر ژن های چسبنده بر روی پلاسمید قرار داشته باشند می توانند به سادگی در میان سوش های مختلف حرکت کنند و شاخص های بیماری زایی را در میان سوش های استافیلوکوک پخش نمایند، این ویژگی چگونگی تنوع وسیع در توانایی بالقوه بیماری زایی را توصیف می کند (7).
1-12- آنزیم های خارج سلولی
1-12-1- کواگولازها
اگر چه ارتباط بین تولید کواگولاز و آسیب زایی ارگانیسم، شاخص بیماری زایی مناسبی را فراهم می کند اما هیچ دلیل قاطعی وجود ندارد که کواگولاز شرکت مستقیمی در بیماری زایی داشته باشد. عملکرد کواگولاز در منعقد کردن پلاسما مشابه با عملکرد تبدیلی فیبرینوژن به فیبرین است که به توسط ترومبین کاتالیز می شود. کواگولاز برای فعالیت کامل آنزیمی خود به یک جزء پلاسما از قبیل پروترومبین و یا مشتقی از پروترومبین تحت عنوان فاکتور واکنش دهنده کواگولاز نیاز دارد. محصول کواگولاز- ترومبین، نه تنها موجب انعقاد فیبرینوژن بلکه موجب فعالیت پروتئولیتیک و استرئولیتیک نیز می شود. فیبرینو پپتیدهایی که آزاد می شوند از فیبرینوپپتیدهای القاء شده توسط ترومبین، متفاوت است. بعضی از این فیبرینوپپتیدها فعالیت فارماکولوژیک قابل مقایسه ای با برادی کینین دارند (7, 91 , 124).
ژن coa که پروتئین کوآگولاز را کد می کند به علت داشتن توالی های متغیر در ناحیه کدکننده ´3 بسیار پلی مورف است و می تواند در متمایز کردن جدایه های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. ناحیه متغیر ژن coa از توالی های تکراری 81 جفت بازی تشکیل شده است که تعداد تکرار این توالی ها در سویه های مختلف استافیلوکوکوس متغیر است (101,44).
1-12-2- لیپاز ها
استافیلوکوک ها چندین آنزیم ئیدرولیز کننده پروتئین ها را تولید می کنند که مجموعاً تحت عنوان لیپازها شناخته می شوند. لیپازها بر روی سوبستراهای متعددی( پلاسما، چربی ها و روغن هایی که بر روی سطح بدن انباشته شده اند) فعال هستند. مصرف این ترکیبات در بقاء ارگانیسم ارزشمند می باشند و لانه گزینی استافیلوکوک ها را در غده چربی توجیه می کند. ظاهراً تولید لیپاز نقشی اساسی در تهاجم ارگانیسم ها در بافت های جلدی و زیر جلدی دارد. در نمونه های اولیه ای که از انسان به دست آمده است نشان داده شده که ارتباط نزدیکی در میان تولید لیپاز و توانایی ایجاد کورک وجود دارد. کاهش قدرت بیماری زایی استافیلوکوک های بیمارستانی که در جریان 20 تا 30 سال گذشته مشاهده شده به موازات کاهش در مقادیر این آنزیم بوده است. احتمالاً این کاهش به علت حضور پروفاژی بوده که به توسط الحاق در ژنوم میزبان، تولید لیپاز را متوقف نموده است (57 ،66، 83).
1-12-3- هیالورونیداز
بیش از 90 درصد از سوش های استافیلوکوک اورئوس، آنزیم هیالورونیداز را تولید می کنند. این آنزیم، اسید هیالورونیک موجود در ماده زمینه ای بین سلولی بافت همبند را تخریب نموده و انتشار عفونت را تسهیل می کند. از آنجایی که پدیده آماس بر خلاف عملکرد انتشاری هیالورونیداز می باشد اهمیت این آنزیم در استافیلوکوک اورئوس مربوط به مراحل بسیار ابتدایی عفونت می باشد(72, 77, 141).
1-12-4- استافیلوکیناز(فیبرینولیزین)
استافیلوکیناز یکی از آنزیم های پروتئولیتیک در استافیلوکوک است که فعالیت فیبرینولیتیک دارد اما از نظر آنتی ژنی و آنزیمی از استرپتوکیناز استرپتوکوک ها متفاوت است. عامل تعیین کننده در تولید استافیلوکیناز، ژنوم فاژ می باشد که در هنگام لیزوژنی، بیان می شود (109 ) استافیلوکیناز برای باز کردن لخته ها، پیش آنزیم پلاسمینوژن را به آنزیم فیبرینولیتیک پلاسمین تبدیل می کند. اگر چه این آنزیم به توسط اغلب سوش های استافیلوکوک اورئوس تولید می شود اما در ارتباط با این که فاکتور مهمی در بیماری زایی باشد شواهد کمی وجود دارد (35, 113).
1-12-5- نوکلئاز
آزاد شدن آنزیم نوکلئاز که یک آنزیم مقاوم در برابر حرارت می باشد منحصراً در استافیلوکوک اورئوس دیده می شود. این آنزیم که در سطح سلول و یا در مجاورت نزدیک با آن وجود دارد یک پروتئین متراکم گلوبولار می باشد که از یک زنجیره واحد پلی پپتیدی تشکیل شده است. حرارت 65 درجه سانتی گراد موجب از هم پاشیدگی ساختمان آنزیم می شود اما این تغییرات به سرعت و به طور کامل، برگشت پذیر می باشد. آنزیم نوکلئاز یک فسفودی استراز با خصوصیات اندونوکلئولیتیک و اگزونوکلئولیتیک است که مولکول های DNA و یاRNA هر دو را می شکند (7).
1-13- توکسین ها
1-13-1- توکسین سیتولیتیک
تعدادی از باکتری ها توکسین هایی را تولید می کنند که موجب از هم پاشیدگی سلول های پستانداران و یا بقیه سلول ها( در شرایط آزمایشگاه) می شود. اغلب این پروتئین ها خارج سلولی هستند که تولید آنتی بادی های خنثی کننده را القا می کنند. از نظر چگونگی واکنش توکسین های سیتولیتیک مختلف( با سطح سلول) تنوع



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید