دانشکده علوم
گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد گرایش اکولوژی تاکسونومی
بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای بلوط ایرانی(Lindl. Quercus brantii) در بخشی از منطقه زاگرس با استفاده از مارکر مولکولی SRAP
پژوهش و نگارش:
ستاره بنیطالبی دهکردی
اساتید راهنما:
دکتر فاطمه رحمانی
دکتر محمد حسن جعفری صیادی
بهمن ماه 1391
حق چاپ و نشر مطالب این پایان نامه برای دانشگاه ارومیه محفوظ است
تقدیم به
پدر و مادر عزیزم
که در لحظهلحظهی زندگیم عاشقانه چشمهی جوشان محبتشان را به پای ریشهی وجودم نثار ساختند و سایبان وجودشان را بر آرامش روحم گستراندند.
بر دستانشان بوسه میزنم و به افتخار حضوری که بر تارک نامم داشتند بر خود میبالم .
حمد و سپاس بیکران خالق پاکی را سزد که تکریم و سپاس به یمن عظمت خلقت او شایستگی یافت، قدرت لایزالی که عالم َبه وجوب سجده بر او ،جبه بر خاک می سایند و نغمه ی ذکر او بر زبان رانند.
بارخدایا!
چگونه ستایمت، که برتر از توان ستایش حقیری چون منی!
و چگونه سنایت را گویم، که تو برتری از هرآنچه بر دل و زبان آرم!
قصور زبانم را به عظمت خود ببخش! و از ناتوانی وجودم به اقتدار بیمثالت درگذر! ای حی دانا !که تو خود واقفی بر حقارت مخلوقت ! در ذکر نهایت کرم وجود تو بر بندگانت همین بس ،که با دمیدن بر روح انسان تمام صفات شایسته خود را با او همراه ساختی،
تا چنانچه بهسبب قدرت اختیار، نفس سرکش را لگد کوب نماید وجودش زیبنده صفات بیبدیل تو شود
ای بخشنده، ای عالم، ای توانا، ای صمد، ای ستارالعیوب و ای مدبّر و …
زان گه که تو را بر من مسکین نظر است آثارم از آفتاب مشهورتر است
گر خود همه عیبها بدین بنده در است هر عیب که سلطان بپسندد هنر است
سپاس، که در هر لحظهی زندگی تو را در کنار خود یافتم و درکشاکش دهر، در پناه تو آرمیدم. و سپاس از تمام لطف و کرمی که هرگز از من مضایقه نفرمودی. اینک که در خوشهچینی از دشت کرمت رهآوردی را به قضاوت اساتید بزرگوار نهادهام. امید دارم در این مرحله نیز با افتخار تاج بندگی چون تویی را مانند همیشه بر سر نهم و طالب علمی شوم آنچنان که لایق بنده توست.
آمین یا رب العالمین
با تشکر ویژه از اساتید گرامی سرکار خانم دکتر فاطمه رحمانی وجناب آقای دکتر محمدحسن جعفری صیادی
و اساتید داور جناب آقای پروفسور کاراپتیان و جناب آقای دکتر حسینی
هماتاقیهای عزیزم و همه دوستان و عزیزانی که در این مسیر خالصانه از هیچ راهنمایی و هدایتی درحق اینجانب مضایقه نفرمودند.
وهمچنین تشکر از مسئولین دانشگاه ارومیه و پژوهشکده زیستفناوری وکلیه اساتید و داوران بزرگواری که با نگاه کاوشگرانه و قضاوت عالمانه خود جویندگان و طالبان علم را، هدایت نموده و برایجاد خودباوری و توانمندی جوانان ایرانی همت گماردهاند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: کلیات
مقدمه و هدف2
گیاهشناسی تیره راش Fagaceae3
شرح تاکسونومیک جنس بلوط Quercus4
1-3-1 خصوصیات تاکسونومیک گونه Quercus brantii5
پراکندگی جهانی این جنس 6
پراکندگی این جنس در ایران7
شرایط اکولوژیکی8
ترکیبات شیمیایی بلوط 8
اهمیت درمانی بلوط8
مصرف خوراکی بلوط10
اهمیت اقتصادی بلوط10
تنوع ژنتیکی11
1-11-1- اهمیت تنوع ژنتیکی و روشهای مختلف ارزیابی آن12
انواع نشانگرها12
1-12-1- نشانگرهای مورفولوژیکی13
1-12-2- نشانگرهای بیوشیمیایی13
1-12-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA 14
1-12-3-1- نشانگرهای غیر مبتنی برPCR 15
1-12-3-2- نشانگرهای مبتنی برPCR 16
1-12-3-2-1 نشانگرPAPD 17
1-12-3-2-2 نشانگرAFLP 17
1-12-3-2-3 نشانگرSSR 17
1-12-3-2-4 نشانگرISSR 18
1-12-3-2-5 نشانگرSRAP و مزایا و معایب آن19
کاربرد نشانگر(مارکر)هایDNA 20
واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR)21
1-14-1- مراحل واکنش زنجیرهای پلیمراز22
تجزیه و تحلیل دادهها24
1-15-1 دندروگرام24
1-15-2 تجزيه خوشه اي25
1-15-3 ضريب شباهت26
1-15-4 انتخاب الگوريتم26
بررسي كارآيي الگوريتم مورد استفاده در تجزيه كلاستر26
شاخص شانون27
بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها براساس آنالیز Nei27
سابقه تحقیق28
1-15-1- مروری بر برخی پژوهشهای انجام شده بر روی Quercus brantii Lindl.28
1-15-2- مروری بر برخی پژوهشهای انجام شده با استفاده از نشانگرSRAP28
فصل دوم: مواد و روشها
2-1- انتخاب مناطق و جمعیتها33
2-2- جمعآوری نمونه ها و آماده سازی آنها34
2-3- استخراج DNA از نمونه های گیاهی34
2-3-1- آماده کردن نمونه ها34
2-3-2- استخراج DNA35
2-3-2-1- مواد موردنیاز35
2-3-2-2- روش کار36
2-4- تعيين كيفيت وكميت DNA37
2-5- واكنش زنجیره ای پلیمراز) (PCR39
2-6- الکتروفورز41
2-6-1- محلول اتيديوم برومايد42
2-6-2- تهیه ژل الکتروفورز43
2-6-3- الکتروفورز محصول PCR43
2-7- تجزيه و تحليل داده ها44
فصل سوم: نتایج و بحث
3-1پلیمورفیسم 46
3-2 بررسی پارامترهای اصلی تنوع ژنتیکی همه لوکوسها در جمعیتهای گونهQuercus brantii Lindl. 50
3-3 بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها براساس آنالیز Nei52
3-4 شباهت و فاصله ژنتیکی بین 5 جمعیت54
3-5 بحث و نتیجهگیری کلی55
3-6 پیشنهادات59
منابع62
فهرست شکلها
شکل1- 1 پراکندگی جهانی جنس بلوط (Quercus)6
شکل 1-2 پراکندگی جنس بلوط(Quercus) در ایران7
شکل 1-3 نمایی از گونه Quercus brantii Lindl.10
شکل 1-4 نحوه اتصال پرایمرهای forward و reverse به DNA الگو20
شکل 1-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز24
شکل2- 1 جمعیتها و مناطق بررسی شده در این تحقیق33
شکل2-2 نمونههای برگ تازه در آزمایشگاه34
شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر برای تعیین کمیت DNA38
شکل 2-4 دستگاه ترموسایکلر41
شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز عمودی42
شکل 2-6 ساختار اتیدیوم برماید42
شکل 2-7 دستگاه ژل داک43
شکل 3-1 الگوی باندی پرایمر46
شکل 3-2 دندروگرام ژنوتیپ های مورد بررسی55

فهرست جداول:
جدول 2-1 اسامی جمعیتها و مناطق بررسی شده در این تحقیق33
جدول 2-2 مواد استفاده شده در PCR39
جدول 2-3 برنامهPCR 40
جدول 2-4 پرایمرهای مورداستفاده در آزمایش40
جدول 3-1 نتایج کدگذاری آغازگر Me2-Em2 برای همهی جمعیتها47
جدول 3-2 نتایج چندشکلی پرایمرهای استفاده شده در این تحقیق49
جدول 3-3 پارامترهای تنوع ژنتیکی همه لوکوسها در کل نمونهها بر اساس مارکر SRAP51
جدول 3-4 شاخصهای تنوع بین جمعیتی HT، HS، GST و Nem در جمعیتهای Q. brantii53
جدول 3-5 جدول ماتریس تشابه بدست آمده برای نشانگر SRAP در بین جمعیتها54
چکیده
بلوط (Quercus) یکی از مهمترین جنسهای چوبی نیمکره شمالی است. این جنس از اصلیترین گونههای درختی ایران به شمار میرود. تاکسونومی و ارتباط تکاملی جمعیتهای بلوط ایرانی بر اساس مارکرهای مولکولی به طور گستردهای مطالعه نشده است. در این مطالعه، ارتباط ژنتیکی جمعیتهای بلوط با به کارگیری مارکر SRAP امتحان شد. پنج جمعیت بلوط از مناطق مختلف زاگرس شامل یاسوج، برمدشت، بیستون، آبدانان و خوزستان جمعآوری و آنالیز شدند. یازده جفت پرایمر SRAP در کل نمونهها 32 باند از 100 تا 400bp ایجاد کردند. 27 تا از این باندها پلیمورف بودند و درصد پلیمورفیسم38/84% به دست آمد. ضریب تشابه نی محاسبه شد و دندروگرام بر اساس UPGMA از روی دادههای SRAP ترسیم شد. دادههای SRAP با به کارگیری نرمافزار popgene در چهار خوشه دستهبندی شد. آنالیز ژنتیکی دامنه تشابه ژنتیکی بین جمعیتی نسبتاً بالا از حداقل 8818/0 بین یاسوج و برمدشت تا حداکثر 9587/0 بین بیستون و آبدانان را نشان داد. جمعیتهای مطالعه شده بلوط تنوع بالایی را نشان دادند: شمار آلل موثر 46/1 بود و شاخص تنوع ژنتیکی شانون (I) به طور متوسط 69/41% بود. جمعیتهای امتحان شده اختلاف ژنتیکی بین جمعیتی نسبتاً بالایی را (2/0 GST=) نشان دادند و جریان ژنی(Nem) 96/1 بود.
واژههای کلیدی: بلوط، تنوع ژنتیکی، مارکر مولکولی SRAP، نی، پلیمورفیسم
فصل اول:
کلیات
1-1 مقدمه و هدف
بلوط (Quercus) از تیره راش (Fagaceae) یکی از متنوعترین جنسهای درختان نواحی معتدل با بیش از 500 گونه در سراسر جهان است(61). بلوط جزء گیاهان پهن برگ است و اساساً این جنس بومی نیمکره شمالی میباشد و شامل گونههای خزانپذیر و همیشهسبز میباشد که در عرضهای جغرافیایی مختلف آسیا و آمریکا گسترده شدهاست (15). از زمان داروین بلوط به عنوان یک جنس مدل برای مطالعه فرآیندهای تکاملی و گونهزایی به کار میرود، سازگاری بالا و مراحل مختلفی از جریان ژنی بین گونهای به طور معنیداری در پیدایش صدها گونه و زیرگونه و اکوتیپهای متعدد مشارکت داشتهاست(21). از یک طرف این انعطافپذیری فنوتیپی و تنوع ژنی باعث موفقیت این جنس در گونهزایی شدهاست و از طرف دیگر این خاصیت مشکلاتی را در تخمین تنوع ژنتیکی بین گونهها و ساختار ژنتیکی جمعیتها و ارتباط تاکسونومیکی بین گونهها ایجاد کردهاست که باید به طریقی این مشکل رفع شود(30). یکی از علل عمده این تنوع ژنتیکی در بلوط فراوانی تبادل ژنی و دخول بین گونههای جنس بلوط هیبریداسیون میباشد(24).
در حال حاضر با فشار ناشی از تخریب و بهرهبرداری از جنگلها توسط انسان، تغییرات اقلیم و پدیده گرم شدن کره زمین پیشبینی میشود، طی 50 تا 100 سال آینده جمعیت بسیاری از گونههای گیاهی در رویشگاههای کنونی ضعیف و ضعیفتر شده (3) و آینده جنگلهای بلوط را با مخاطرات جدی مواجه سازد. همچنین وجود مشکلاتی نظیر کمبود درختان مادری، تناوب سال بذردهی، آفات و امراض، تولید دانه ناکافی و نامناسب، ضعف دانهزادی و عدم نگهداری دانهها برای مدت طولانی (63)، روند احیاء طبیعی جنگلها را از طریق بذر با مشکل روبرو کردهاست. تدوین برنامه حفاظت از منابع ژنتیکی بلوط و توسعه و احیاء جنگلهای آن از طریق بذرکاری و نهالکاری میتواند از جمله مهمترین و اصولیترین اقدامات احیایی و حفاظتی رویشگاههای این جنس باشد. بطورکلی گزارشات موجود نشان میدهد که در بسیاری از موارد به دلیل ناسازگاری ژنتیکی نهالهای کاشته شده با شرایط محیطی(15)، نرخ پایین زندهمانی آنها(51)، باید توسط بذر ژنوتیپهایی جنگلکاری شود که با شرایط اقلیمی دورههای آینده سازگاری داشته باشد. با این وجود تنظیم و اجرای برنامههای حفاظت از منابع ژنتیکی و جنگلکاری با بذر ژنوتیپهای سازگار با استرسهای احتمالی نیازمند کسب اطلاع از تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیتها است(53).
علاوه بر اهمیت اکولوژیکی بلوط، این جنس دارای مصارف دارویی، خوراکی و صنعتی فراوان نیز میباشد(28). این جنس یکی از مهمترین گیاهان چوبی تشکیلدهنده جنگلهای بلوط غرب محسوب میشود ولی به دلیل دور شدن این جنگلها از حالت کلیماکس و کاهش قابل توجه گونههای جنگلی تعیین تنوع ژنتیکی و حفاظت ذخایر آنها ضروری به نظر میرسد(23).
مطالعات قبلی مدارک فراوانی را مبنی بر تنوع بینگونهای براساس کاراکترهای فنوتیپی فراهم کردهاند تنوع در این جنس براساس ویژگیهای بیولوژیک، مورفولوژیک و فنولوژیک شناسایی و شرح داده شده است، به خصوص مورفولوژی برگ در این مورد مفید است و ساختار جمعیت بلوطها بر اساس ویژگی مورفولوژیکی برگ مطالعه شده است (61 و 21). تاکنون مطالعه روی تنوع ژنتیکی درون گونهای بلوط ایرانی در مناطق مختلف ایران با استفاده از مارکر SRAP صورت نگرفته است.
مارکرهای مولکولی مهمترین و کاربردیترین سیستمهای مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هر روزه در حال توسعه و تکامل هستند، و از آنجا که در اولین سطح از بیان ژن مطرح می شوند خیلی دقیق بوده و دارای تنوع زیاد و پلی مورفیسم بالا هستند (15). در بین نشانگرهای مولکولی ریزماهوارهها به دلیل توانمندیهای ویژهای که در شناسایی تنوع ژنتیکی ارقام و گونههای مختلف درختان دارند از کارایی بالایی برخوردارند. هدف از کار حاضر ارزیابی امکان بکارگیری مارکر SRAP در مطالعات ژنتیکی درونگونهای بلوط و مطالعات ژنتیک جمعیت و سنجش تنوع ژنتیکی در جمعیتهای مختلف این گونه و تخمین ساختار ژنتیکی و اختلاف بین جمعیتها در قسمتهای مختلف قلمرو آن در جنگلهای زاگرس است که امید میرود کمکی در جهت طبقهبندی این جنس و بهنژادی این گیاه در آینده باشد.
1-2 گیاهشناسی تیره راش (Fagaceae)
تیره راش (بلوط یا پیالهداران) در جهان دارای 6 جنس و حدود 600 گونه است. درختان یا درختچههایی یکپایه، خزانکننده یا همیشهسبز هستند. برگها متناوب، ساده، کامل، دندانهدار، کنگرهدار یا دارای لوبهای شانهای، دمبرگدار گوشوارکدار که زودافت و در برخی پایا هستند. گلها یکجنسی و در سنبلههای دمگربه ای مجتمعاند. گلهای نر دارای کاسهای کوچک با تعدادی پرچم و گلهای ماده دارای کاسهای کوچک چسبیده به 3 تا 6 برچه با تمکن محوری و تخمدان زیرین و دارای خامه و کلالههای آزاد هستند. در کنار هر برگک سنبلهی ماده معمولا گلآذین گرزنی شامل 3 گل وجود دارد که گاهی فقط یک گل از آن به رشد خود ادامه میدهد. گلهای ماده را اندامی پیالهای شکل حاصل از تراکم برگکهای فلس مانند محصور میکند که همراه با رشد فندقهها رشد میکند و نقش حفاظت فندقه را بر عهده میگیرد. در هر گل فقط یک برچه میتواند به رشد خود ادامه دهد و به یک فندقه تبدیل شود. گاهی گیاهشناسان گیاهان این تیره را به دلیل داشتن کاسه گل پیالهمانند، که به خصوص در بلوط و شاهبلوط قابل توجه است، پیالهداران نیز میگویند (10و8).
1-3 شرح تاکسونومیک جنس بلوط Quercus
بلوط یکی از متنوعترین جنسها از درختان نواحی معتدل است که بر اساس گفتهی محققان شمار گونههای بلوط بین 300 تا 600 متفاوت است (61). در این جنس سنبله نر به شکل شاتون آویخته و محور آن دارای گلهای منفردی با پوششی متشکل از پنج قطعه در قاعده است که به هم متصل شده و دارای 5 یا تعدادی پرچم است. سنبله ماده معمولاً کمگل است و غالباً فقط به یک گل یا دو گل ختم میشود. بخش پایین هر گل را اجتماعی از فلسها به صورت پیاله محصور میسازد. گلپوش دارای 6 قطعه واقع در دو حلقه است. مادگی زیرین و دارای دو تخمک واژگون بوده و خامه به کلاله سهبخشی منتهی است. میوه بصورت فندقه بزرگی با برونبر چرمی است که قاعدهی آن درون پیالهای مقاوم قرار دارد. مادگی در جریان رشد تمام تخمکهای خود را از دست داده و فقط یکی از آنها به رشد خود ادامه میدهد، بنابراین میوه بلوط یک فندقهای است. بیشتر گونههای بلوط درختان بلند جنگلی با تنههای ضخیم و چوبی سخت و مقاوم هستند. بلوطها گاهی بیشتر از 200 سال عمر میکنند (8). بسیاری از گونههای بلوط دارای هر دو نوع تولید مثل جنسی و غیرجنسی هستند. تولید مثل جنسی از طریق تولید دانه و تولید مثل غیرجنسی از طریق پاجوشهای ریشه صورت میگیرد و افراد حاصل در پاسخ به فاکتورهای اکولوژیکی و ژنتیکی متنوع میشوند (14). ردهبندی بلوط بر اساس ردهبندی کرانکوئیست به صورت زیر میباشد:
Kingdom: Plantae
Division: Magnoliophyta
Class: Magnolipsida
Order: Fagales
Family: Fagaceae
Sub Family: Quercoideae
Genus: Quercus
1-3-1 خصوصیات تاکسونومیک گونه Lindl. Quercus brantii
درختی است که هیچگاه مرتفع نیست (شکل1-3)، حداکثر به ارتفاع 10 متر، با پوست خاکستری، شیاردار، شاخههای جوان با کرکهای زرد نمدی یا نمدی خاکستری شونده، جوانهها تخممرغی به طول 2 تا 5 میلیمتر با فلسهای درشت، کرکدار. برگها در زمستان ریزان، در روی سطح فوقانی با کرکهای ستارهای تنک، سطح تحتانی با کرکهای ستارهای زرد یا خاکستریشونده گاهی مخلوط با کرکهای غدهدار پتویی؛ پهنک به طول 6-10 (15-) و عرض 4-7 (9-) سانتیمتر، تخممرغی یا مستطیلی تخم مرغی، با قاعده قلبی، دندانههای 7 تا 14 تایی کوتاه با نوکی به طول 1-2 میلیمتر؛ رگبرگهای فرعی 8-16 جفت، موازی، تا میان دندانهها ممتد (در میان دندانهها نفوذ می کند)؛ رگبرگهای بینابینی (فرعیتر) وجود ندارد؛ دمبرگ به طول 1-2 سانتیمتر. گل آذین دمگربهای نر به طول 4-6 سانتیمتر، با محور کرکدار؛ گلپوشهای نر با بریدگیهای پهن 4-6 تایی کمعمق (هیچگاه بریدگیها عمیق نیستند)، بریدگیها به نیمه گلپوش نمیرسند؛ پرچمها 5-7 تایی. گلهای ماده منفرد یا دوتایی، با محوری به طول 15 سانتیمتر. پیاله نیمهکروی یا مخروطی که 20 تا 50 درصد میوه را در بر میگیرد، به ارتفاع 2-3 سانتیمتر وقطر 4 سانتیمتر، با فلسهای درشت، کرکدار، به صورت افقی گسترده. میوه بلوط به طول تا 5 سانتیمتر، با زخم محدب. این گونه اغلب گال ایجاد میکند(11).
-4 پراکندگی جهانی این جنس
این جنس بومی نیمکره شمالی (اروپا، افریقا، آمریکای شمالی و آسیا مخصوصا در جزایر پلینزی در اقیانوس آرام) است (14) و از نواحی قطبی تا نواحی نیمهخشک پراکنده شدهاست (16). مکزیک یکی از مراکز تنوع جنس بلوط است که دارای 135 تا 150 گونه شامل 86 گونه اندمیک میباشد (61)(شکل1-1).
شکل1- 1 پراکندگی جهانی جنس بلوط (Quercus)
1-5 پراکندگی این جنس در ایران
در ایران نیز چند گونه بلوط در جنگلهای شمال و غرب ایران انتشار دارند Q. macranthera با نام محلی اوری و Q.castanefolio با نام محلی مازو از مهمترین جنگلهای شمال و ارسباران هستند (5). جنگلهای زاگرس که جنگلهای بلوط غرب نیز نامیده می شود با طول تقریبی 1300 کیلومتر در امتداد رشتهکوه زاگرس از جنوب آذربایجان غربی تا استان فارس ادامه دارند (21 و 14). درخت بلوط از بارزترین گیاهان درختی به شمار میرود (21). زاگرس جنوبی رویشگاه خالص گونه Q.brantii Lindl. یا بلوط ایرانی میباشد(شکل1-2).
شکل 1- 2 پراکندگی جنس بلوط(Quercus) در ایران
1-6 شرایط اکولوژیکی
درخت بلوط در خاک پررس مرطوب رشد میکند ولی خاکهای شنی را نیز تحمل میکند. این درخت در مناطق جنگلی و پست یافت میشود. جنگلهای بلوط به دوره کوتاه خشکی در تابستان و باران زیاد در بهار نیاز دارند (2).
1-7 ترکیبات شیمیایی بلوط
در پوست و برگ درختان بلوط تاننهایی وجود دارد که از نظر ترکیب شیمیایی مشابهت نزدیک با یکدیگر دارند. پوست شاخههای جوان برخی گونههای دارویی دارای 10 تا 20 درصد (در شاخههای مسن 0 تا 10 درصد) از نوعی تانن فیزیولوژیکی یعنی اسید کوئرسیتانیک1 محلول در آب، نوعی قند محلول در آب به نام کوئرسیت2، 6/1 درصد اسید گالیک، اسید مالیک، یک ماده تلخ به نام کوئرسین3 ، فلوروگلوسین، موسیلاژ، مواد پکتیکی، مواد رزینی، اکسالات کلسیم و نوعی ماده رنگی قرمز به نام قرمز بلوط و به مقدار کم از کولاکاتشین4 و غیره است. میوه دارای 5 درصد ماده روغنی، 65/6 درصد پروتئین، 7 درصد از قندهای مختلف، 3/44 درصد آمیدون، 2/3 درصد پنتوزان، مقدار کمی کوئرسیت و معادل 7 درصد از نوعی تانن است. در گال که بر روی برگ و جوانههای بلوط تحت اثر گزش حشرات مخصوص از دسته نیمبالان، ایجاد میشود نوعی تانن به نام اسید گالوتانیک5 یافت میشود که سابقا آن را انیدریدی از اسید گالیک تصور مینمودند و در نتیجه آن را اسیددیگالیک6 نوعی گلوکوزید تصور میکردند (4).
1-8 اهمیت درمانی بلوط
اهمیت درمانی درختان بلوط بیشتر مربوط به تاننی است که در اندامهای آن فراهم میشود. این ماده را باید یکی از شاخصترین موادی دانست که در عالم گیاهان تولید میشود. این ماده مهم گیاهی خواص مختلفی نظیر رسوب دادن آلبومین، به وجود آوردن پوشش محافظ برای بافتها، جلوگیری کردن از عفونیشدن و غیره را داراست. طبق بررسیهایی که به عمل آمده است فراوردههای تانن تاثیر مثبتی در درمان سل، التیام زخمها و جلوگیری از ترشحات مخاط دارند. اعضای مختلف درختان بلوط به علت دارا بودن تانن اثر قابض، بند آوردن خون و تقویتکننده عمل بعضی از اعضای بدن را دارند. برگ بلوط در بیماریهای مختلف مانند اختلاط خونی، خونرویهای مختلف، زخم معده، آغاز بیماری سل، دیسانتری، بیاختیاری دفع ادرار در اطفال، رفع ترشحات زنانگی و بواسیر اثر قاطع دارد. در استعمال خارجی، جوشاندههای غلیظ آن به صورت غرغره در معالجه ورم حنجره و لوزه مؤثر واقع میشود.
پوست درخت بلوط (Q. robur) پادزهر خوبی در مسمومیتهای ناشی از آلکالوئیدها است و اثر غیرقابلانکاری در رفع خونرویها، اختلاط خونی، سل، نرمی استخوان و غیره دارد (پوست گونههای دیگر به علت دارا بودن تانن فراوانتر کمتر در مصارف داخلی بکار میروند). باید توجه داشت مصرف زیاد یا طولانی مدت آن باعث خستگی عضلات معده، احساس درد عضله قلب و تحریک دستگاه هضم میشود. ارزش درمانی پوست بلوط در استعمال خارج، بیشتر از مصارف داخلی آن است مانند آن که استعمال جوشاندههای گرد پوست بلوط، به صورت حمامهای موضعی، لوسیون، غرغره، تنقیه و شستشو به صورتهای مختلف، جهت درمان بیماریها در موارد اولسرهای سرطانی، التهاب غدد به علت انسداد مجاری آنها، خونمردگی سوداء، بیماریهای مزمن پوستی دیگر، اگزما، واریس، خیز عمومی بدن و غیره میتوان استفاده کرد. از لوسین موجود در پوست درخت بلوط، در موارد انسداد مجاری لنفاوی، دررفتگی اعضا، جمع شدن آب در مفاصل، سرمازدگی، اولسرهای عفونی و اولسرهای قانقاریایی چرکین نیز استفاده میشدهاست، به علاوه آن را در موارد بروز ترشحات مهبلی و سوزاکهای مزمن و غیره هم بکار میبردهاند.
میوه بلوط جهت رفع اسهال و درمان دیسانتری، سوءهاضمه، درد معده، نزلههای مزمن، کمخونی، نرمی استخوان، سیاهسرفه، درمان سل در مراحل اولیه، سستی و ضعف استخوانها و غیره به کار میرود. مخلوط آرد میوه بلوط بوداده با کاکائو، بهترین دارو جهت رفع اسهالهای ساده اطفال است.
گالها به عنوان مقوی معده، قابض و رفعکننده خونرویها به کار میروند (4).
1-9 مصرف خوراکی بلوط
میوه فندقه درختان بلوط که عموماً در پیالهای جای دارد و آکورن نامیده می شود، از قدیم مورد استفاده مردم دنیا بودهاست. طعم آن در بعضی گونهها مانند Q. ballota Desf مخصوصاً نژادی از آن که در الجزیره و اسپانیا میروید بسیار مطبوع است. بعضی از گونههای آمریکا و برخی از انواع موجود در ایران نیز میوههای خوراکی دارد و از آنها برای تغذیه استفاده میشود. از مخلوط آرد میوه درشت بلوط با آرد گندم، در بعضی نواحی نان تهیه میشود. در دورانهای قبل میوه بلوط را بو میدادند تا تانن آن با این عمل کاهش یابد سپس از آن در تهیه نوعی قهوه استفاده میکردند، این قهوه دارای دکسترین به جای آمیدون میوه است (4). میوه بلوط هم به صورت مستقیم مورد تغذیه دام و وحوش قرار میگیرد و هم جمعآوری شده و به عنوان علوفه زمستانی مورد تغذیه دام قرار میگیرد (2).
1-10 اهمیت اقتصادی بلوط
درخت بلوط از مهمترین درختان جنگلی ایران محسوب میشود. چوب آن دارای مصارف صنعتی است. چوب بلوط دارای چگالی g/cm375/0 بوده و استحکام و سختی زیادی دارد و نسبت به حشرات و حمله قارچها بسیار مقاوم است و بافت بسیار جالبی دارد. پوست و گالهای درخت بلوط هم سرشار از تانن هستند و در صنعت چرمسازی و رنگسازی مورداستفاده قرار میگیرد (5).
شکل 1-3 نمایی از گونه Quercus brantii Lindl.
1-11 تنوع ژنتیکی :
تنوع ژنتیکی به تنوع ژنی درون گونهها اطلاق میشود. به عبارتی تنوع ژنتیکی، تنوع قابل توارث درون و بین جمعیتهاست. کلیه تنوعهای موجود با توالی چهار جفت باز تشکیلدهنده مولکول DNA، اجزا سازنده کدهای ژنتیکی مرتبط میباشند. انواع دیگری از تنوع ژنتیکی را نیز میتوان در کلیه سطوح سازماندهی شده در هسته شامل مقدار DNA، تعداد کروموزم و ساختار DNA شناسایی کرد. تنوع و تکامل ژنتیکی در جمعیتهای گیاهی میتواند بوسیله جهش، نوترکیبی، مهاجرت، رانده شدن ژنتیکی و گزینش ژنتیکی ایجاد شده باشد (64). کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی در بین افراد یا جمعیتها و آگاهی از روابط خویشاوندي گونههاي موردنظر در برنامههاي اصلاحی، امکان سازماندهی ژرمپلاسم و نمونهگیري مؤثر از ژنوتیپها را فراهم میسازد (1). قدم اول در اصلاح خصوصیات گیاهی، فهم از ساختار کلکسیون ژرمپلاسم است که این موضوع به نوبه خود نمونهگیري سیستماتیک ژرمپلاسم را براي مقاصد اصلاحی و حفاظتی امکانپذیر میسازد. براي بهرهبرداري از منابع ژنتیکی با حداکثر کارآیی، شناخت مواد ژنتیکی نگهداري شده ضرورت دارد. ارزیابی نمونهها میتواند با توجه به هدف استفاده از ژرمپلاسم صورت گیرد که جنبههاي اگرونومیکی، پاتولوژیکی، مورفولوژیکی، سیتولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی از جمله این اهداف است. در راستاي این ارزیابی نقاط قوت و ضعف تودهها و ژنوتیپها و پتانسیلهاي موجود در آنها شناخته میشود. به عبارت دیگر در این ارزیابیها وسعت پایه ژنتیکی هر صفت معلوم میگردد (12 ،7 و6) تنوع ژنتیکی یک صفت معین، اندازه پراکنش ارزشهاي همان صفت است، به طوري که تأثیر محیط بر آن زدوده شده باشد. تنوع بین گیاهان یک گونه گیاهی خاص بر دو نوع است: تنوع بر اثر محیط، که به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش میدهد و با مقایسۀ گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، میتوان آنرا مشاهده نمود. تأثیر محیط روي یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمیشود و بنابراین انتخاب در یک جامعه یکنواخت ژنتیکی، به جدا نمودن نژادهایی که در واکنش به تنشهاي محیطی اختلاف دارند، نمیانجامد. تنوع ارثی به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال مییابد، اطلاق میگردد .از آنجایی که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و به نتاج قابلیت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامههاي اصلاحی حائز اهمیت است، منشأ تنوع ارثی در گیاهان، نوترکیبیهاي ژنتیکی، تغییرات درکروموزومها و جهشها است (7).
1-11-1 اهمیت تنوع ژنتیکی و روشهای مختلف ارزیابی آن
شناخت کیفی و کمی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی در علوم بیولوژی مانند اکولوژی، بیولوژی تکامل، تاکسونومی یا ردهبندی، ژنتیک و اصلاح نباتات برخوردار است. اهمیت تنوع ژنتیکی به خوبی برای همه روشن بوده و نشان داده شده است که کاهش تنوع ژنتیکی میتواند منجر به کاهش شایستگی و سازگاری به تغییرات محیطی گردد. ارزيابي تنوع ژنتيكي معمولاً در سطح مولكولي و با استفاده از چندين روش آزمايشگاهي انجام مي‌گیرد كه از آن ميان مي‌توان به آللوزايمها7 ، آنالیز DNA8 و ایزوزیم9ها اشاره كرد كه قادرند ارزيابي دقیقی از تنوع ژنتيكي را فراهم نمایند. ارزیابی ترکیب ژنتیکی گیاهان زراعی و مجموعههای ژنتیکی و قرابت بین آنها از گذشتههای دور معمول بوده است، بطور تاریخی این تخمین براساس بیولوژی اندامهای جنسی، دادههای اکوجغرافیایی، زیستشناسی، رنگیزهها و شجرهنامه و اخیراً با استفاده از نشانگرهای پروتئینی مانند ایزوزایم صورت میگرفته است همچنین تنوع ژنتيكي ممكن است با استفاده از صفات مورفولوژيكي نیز مورد ارزيابي قرار گيرد. بررسی صفات مورفولوژيكي به تكنولوژي گراني نياز ندارد ولي اغلب، این فعالیتها به زمين وسيعي نياز دارند که اين امر مي‌تواند سبب شود كه اين روش نسبت به روش‌هاي مولكولي هزینه بیشتری داشته باشد. بعلاوه اين صفات اغلب تحت تأثير نوسانات محيطي قرار مي‌گيرند كه موجب مي‌شود ارزيابي تنوع تحت تأثير محيط باشد. با بررسی مجموعههای ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA، تفاوتهای ژنتیکی بیشتری مشاهده شده، این تفاوتها تحت تأثیر محیط و اثراتی مانند پلیوتروپی، اپیستازی و دوره رشدی گیاه نخواهند بود و امکان آگاهی دقیق و کافی از تنوع ژنتیکی در سطح DNA را فراهم میسازند. با توجه به اهمیت روزافزون تولید واریتههای برتر و نیاز به شناسایی و استفاده از آللها و ژنهایی که صفات مطلوبی را کنترل مینمایند، استفاده از نشانگرهای DNA روزافزون خواهد بود.
1-12 انواع نشانگرها:
مارکرها انواع مختلفی دارند. در یک تقسیمبندی کلی میتوان مارکرها را به صورت زیر دستهبندی کرد:
1- مارکرهای مورفولوژیکی یا فنوتیپی
2- مارکرهای مولکولی
مارکرهای مولکولی خود به دو دسته تقسیم میشوند:
1- مارکرهای بیوشیمیایی
2- مارکرهای DNA
1-12-1 نشانگرهای مورفولوژیکی
مارکرهای مورفولوژیکی همانگونه که از نام آنها مشخص است از روی فنوتیپ ارزیابی میشوند و لذا ارزیابی آنها خیلی ساده است. تعداد این مارکرها کم است و پلیمورفیزم کمی نیز تولید میکنند. از طرفی در اغلب موارد مارکر فنوتیپی در واقع یک صفت نامطلوب است، مثلا کوتولگی بوته، ابلق بودن برگ ها و … . لذا امروزه از این نوع مارکرها استفاده نمیشود. نشانگرهاي مورفولوژیکی اولین نشانگرهایی بودند که براي ارزیابی تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند (20). نشانگرهاي مورفولوژيك كه پيامد جهشهاي قابل رويت در مورفولوژي هستند، شامل دامنه وسيعي از ژن‌هاي كنترلكننده صفات مورفولوژيك ميشوند كه بر ظاهر يا فنوتيپ موجود مبتني بوده و جزو نخستين نشانگرها به شمار ميآيند كه از زمانهاي بسيار دور، يعني زماني كه هنوز محل ژن روي كروموزوم مشخص نشده بود، مورد استفاده قرار ميگرفتند. دلایل عمده محدودیت استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی عبارتند از: تعداد این نشانگرها کم بوده، وابسته به سن و مرحله رشدي گیاه هستند و غالباً از شرایط محیطی تأثیر ميپذيرند و درضمن اساس ژنتیکی بسیاری از آنها هنوز مشخص نشده است. در صورتی که هنوز بررسی تنوع ژنتيكي بر اساس صفات مورفولوژیک یک گام اولیه در جهت توصیف و گروهبندی ژرمپلاسمها است (57).
1-12-2 نشانگرهاي بيوشيميايي
نشانگرهای بیوشیمیایی شامل موارد متعددی است. این نوع مارکرها نیز امروزه کارایی زیادی ندارند چرا که تعداد آنها کم بوده و پلیمورفیزم کافی ایجاد نمیکنند، لیکن نکته مثبت در آنها همبارز بودن است.
این گروه را میتوان به دستههای زیر تقسیم کرد:
الف. مولکولهای بیوشیمیایی کوچک: مثل ترکیبات فنلی، ترکیبات معطر و …
ب. پروتئینهای ذخیرهای: مثل گلوتنین و گلیادین که در گندم خصوصا در تعیین ارزش نانوایی کاربرد دارد.
ج. آیزوزایمها: اینها در واقع فرمهای مختلف یک آنزیم هستند که یک واکنش را کاتالیز میکنند ولی ممکن است سرعت فعالیت آنها متفاوت باشد. این مارکرها در دهه 80 کاربرد زیادی داشتند. تنکسلی توانست بر اساس آیزوزایمها در گوجه فرنگی اولین نقشه لینکاژی را طراحی نماید. و معايب آيزوزايم‌ها عبارتند از: تنها تعداد محدودي آيزوزايم برای هر گونه وجود دارد، تعداد سیستم‌های آنزیمی چند شکل و قابل دسترس محدود است و مكان‌های آنزيمي فقط شامل قسمت محدود و غيرتصادفي از ژنوم هستند (قسمت بيانشونده). بنابراين تنوع مشاهده شده ممكن است بيانگر كل ژنوم نباشد. اگرچه با اين روش مي‌توان تعداد زيادي از نمونه‌ها را بررسي کرد ولي مقايسة نمونه‌ها از گونه‌هاي مختلف، مكان‌هاي ژني و آزمايشگاه‌هاي مختلف مشكل ساز است. بطوريكه اين روش تحت تأثير روش‌هاي استخراج، بافت گياه و مرحلة رشد گياه قرار مي‌گيرد(62و42).
د. آللوزايم‌ها آلل‌هاي متفاوت آنزيم‌ها هستند كه يك ارزيابي از فراواني ژني و ژنوتيپي در درون و بين جمعيت‌ها ارائه مي‌دهند که اين اطلاعات مي‌توانند جهت گروه‌بندي جمعيت‌ها، تنوع ژنتيكي، جريان ژن، ساختار ژنتيكي گونهها، مقايسة ميزان تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي، ساختار جمعيت و واگرايي جمعيت‌ها استفاده شوند (42).
مزيتهاي مهم اين‌گونه نشانگرها عبارتند از: ارزيابي به صورت هم‌بارز و بدون دخالت تأثيرات اپيستازي و پليوتروپي، كاربرد آسان و هزينة پائين.
1-12-3 نشانگرهاي مولكولي مبتنی بر DNA
مارکرهای DNA در واقع مهمترین و کاربردیترین سیستمهای مارکری هستند که گستردگی زیادی داشته و هرروزه در حال توسعه و تکامل هستند. از آنجا که در اولین سطح بیان ژن مطرح میشوند، خیلی دقیق بوده، دارای تنوع زیاد و پلیمورفیزم بالا هستند.
نشانگرهاي مولكولي بر اساس آشكارسازي تفاوت‌ (چندشکلی10) موجود در بين اسيدهاي نوكلئيك افراد مختلف عمل مي‌كنند. اين تفاوت‌ها شامل پديده‌هاي حذف، اضافه، جابجايي، دو برابر شدن و جهش‌هاي نقطه‌اي است و تنها ژن‌هاي خاص و فعال را شامل نمي‌شود. نشانگرهاي مولكولي علاوه بر اينكه تحت تأثير محيط نيستند داراي مزيت‌هاي زير میباشند:
1- تمام قسمت‌هاي ژنوم را پوشش مي‌دهند (اگزون‌ها، اينترون‌ها و نواحي تنظيمكننده).
2- تحت تأثير پليوتروپي و اپیستازي قرار نمي‌گيرند.
3- قادر به شناسايي تفاوت‌هايي هستند كه تنوع فنوتيپي نشان نمي‌دهند.
4- بعضي از آنها هم‌بارز هستند.
روش‌هاي مختلف مورد استفاده شامل: هضم و هيبريداسيون اسیدهای نوکلئیک، روشهای مبتني بر واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز (11PCR) و يا تركيبي از دو روش ذكرشده هستند. بعلاوه روش‌هاي مختلف نشانگري می‌توانند يك مكان يا چند مكان ژنومي را مورد بررسي قرار ‌دهند. بطوریکه نشانگرهای چند مکانی12 قادرند بطور همزمان چندین مکان ژنومی را مورد بررسی قرار دهند. اين نشانگرها مبتني بر تكثير تصادفي DNA بواسطة آغازگرهاي اليگونوكلئوتيدي با توالي‌هاي انتخابي هستند، اين گونه نشانگرها را نشانگر‌هاي غالب نيز مي‌نامند. بنابراين امكان تشخیص حضور يا عدم حضور باند براي هر مکان وجود دارد ولي امكان تشخيص حالت‌هاي هتروزيگوت (A/-) يا هموزيگوت (a/a) براي آلل‌هاي مشابه وجود ندارد. در حاليكه نشانگرهاي يك مكاني13 از كاوشگرها يا آغازگرهاي ويژه براي مكان‌هاي ژني استفاده مي‌كنند و قادر به تكثير يا دورگگيري DNA با توالي‌هاي شناختهشده هستند. اين نشانگرها را نشانگرهاي هم‌بارز نيز مي‌نامند كه امكان تشخيص مكان‌هاي هموزيگوت و هتروزيگوت را به ما مي‌دهند(42).
روش‌های نشانگري پايه را مي‌توان به 2 دسته تقسيم كرد:
1-روش‌هاي غير مبتني بر PCR یا روش‌هاي مبتني بر هيبريداسيون.
2-روش‌هاي مبتني بر PCR
1-12-3-1 روش‌های غير مبتني بر PCR
روشهاي مولكولي مبتني بر هيبريداسيون از اولین نشانگرهایی هستند که در مطالعات گياهي مورداستفاده قرار گرفتند. این نشانگرها شامل استفاده از آنزيم‌هاي برشي و روش‌هاي دورگگيري بودند (59). آندونوكلئارهاي هضمكننده، آنزيم‌هاي باكتريايي هستند كه قادر به شناسايي توالي‌ پاليندرم ويژه و برش DNA هستند كه اين برش سبب ايجاد قطعاتي با اندازه‌هاي مختلف مي‌شود. تغييرات درون توالي (مثل جهش نقطه‌اي)، جهشهاي بين مكانی (مثل حذف و جابجايي) و جهشهاي درون مكان آنزيمي مي‌توانند منجر به تفاوت طول قطعات بعد از برش آنزيمي شوند. نشانگرهاي RFLP14 و تعداد متفاوت رديف‌هاي تكراري (15VNTR)، نمونه‌هايي از نشانگرهاي مبتني بر هضم و هيبريداسيون هستند. در RFLP چندشكلی DNA بوسيلة هيبريداسيون كاوشگر (كه به روش شيميايي نشاندار شده است) با قطعاتDNA انتقال سادرنيافته انجام مي‌گيرد كه سبب ایجاد پروفايلهايي از قطعات DNA میشود. نشانگر RFLP داراي چندشكلي نسبتاً زيادي است، توارث همبارز داشته و تكرارپذيري بالايي نشان مي‌دهد. در این روش لكه‌هاي DNA حاصل از دورگ گیری را مي‌توان پاك كرد و قطعات انتقال سادرنیافته را دوباره با کاوشگرهاي 16‌ RFLP جديد (8 تا 10 مرتبه) مورد بررسی قرار داد. با این وجود، اين روش‌ها به علت وقت‌گير بودن، داشتن مواد راديواكتيويتهی گرانقيمت و سمي و نياز به DNA با كيفيت و كميت بالا به طور وسيع مورداستفاده واقع نمي‌شوند. بعلاوه این نشانگرها به اطلاعات اوليه از توالي DNA‌ جهت ساختن كاوشگر نياز دارند كه سبب پيچيدگي روش مي‌شود. اين محدوديت‌ها سبب شده است كه روش‌هاي با پيچيدگي كمتر مانند نشانگرهای مبتني بر PCR توسعه یابند (42). بازرترین نوع این مارکرها، RFLP میباشد. VNTRها و میکروستلایتها نیز در این گروه قرار دارند. در این نوع مارکرها یک قطعه DNA نشاندار شده (پروب) جهت هیبریداسیون استفاده میشود. RFLP در سال 1980 توسط Botstain ابداع شد و دقت بسیار زیادی دارد، لیکن امروزه صرفا به دلیل وقتگیر و پرزحمت بودن آن، کمتر استفاده میشود.
1-12-3-2 نشانگرهاي مبتني بر PCR
اين نشانگرها كه كاربرد آنها سير صعودي دارد، توسط موليس و همكارانش (1986) توسعه پيدا كرده و از واكنش‌هاي زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) پيروي مي‌كنند. اين تكنيك شامل تكثير چندين قطعه DNA مجزا است كه توالي‌هاي اطراف آنها بسيار مشابه آغازگر مي‌باشد، اين نواحي بايد به قدر كافي به همديگر نزديك باشند تا تكثير انجام گيرد. استفاده از آغازگرهاي تصادفي محدوديت داشتن اطلاعات اوليه براي انجام PCR را ندارد. روش‌هاي مبتني بر PCR را مي‌توان به دو گروه: 1- روش‌هاي مبتني بر PCR تواليهاي غير ويژه. 2- روشهای مبتني برPCR توالي‌هاي هدف17 تقسيم كرد. در این قسمت تعدادی از نشانگرهای مبتنی بر PCR توضیح داده میشود (42).
1-12-3-2-1 نشانگرRAPD18:
نشانگر RAPD، نخستین نشانگر مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره پلیمراز بود که برای بررسی تنوع ژنتیکی مورداستفاده قرار گرفت. ماركرهاي RAPD از طریق تكثير تصادفي DNA ژنومي و با استفاده از آغازگرهاي كوتاه ایجاد میشوند. تفکیک قطعات حاصل بر روی ژل آگارز در حضور اتيديوم برومايد صورت ميگيرد، و در نهايت، زير نور ماوراء بنفش مشاهده میگردد. اگرچه آغازگرها دارای تواليهای تصادفي هستند، قادر به يافتن تواليهاي هومولوگ مناسب روی رشته DNA ميباشند. چندشكلیهاي DNA بدلیل نوآرايي يا حذف در محل اتصال آغازگرها یا ناحیه قابل تکثیر ايجاد ميشوند (68).
1-12-3-2-2 نشانگر19AFLP:
برای غلبه بر محدودیت تکرارپذیری RAPD، تکنولوژی AFLP توسط شرکت هلندی کیجن20 توسعه پیدا کرد (68). نشانگر AFLP توسط هضم DNA با دو یا چند آنزیم برشی، اتصال آداپتور به دو انتهای قطعات، PCR با آغازگرهای اختصاصی و جداسازی قطعههای حاصل روی ژل پلی اکریل امید صورت میگیرد (12). با توجه به نتایج بدستآمده از آن تکنیک مقرون به صرفه و دارای تکرارپذیری، ثبات و قابلیت اطمینان بیشتری نسبت به مارکر RAPD میباشد به همین دلیل بطور وسیعی در تهیه نقشه کروموزومی گیاهان مورداستفاده قرار گرفته است. در استفاده از این مارکر باید مراحل انجام کار با دقت و کیفیت بالا صورت گیرد (65).
1-12-3-2-3 نشانگر21SSR:
مورگانت و اولیویری در سال 1993 برای اولین بار ریزماهوارهها را در توالی گیاهان گزارش کردند. ریز ماهوارهها یا ردیف های تکراری ساده (SSR) شامل واحدهای نوکلئوتیدی تکی تا شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم بیشتر یوکاریوتها پراکندهاند (26). معمولاً تکرارهای 1 تا 4 نوکلئوتیدی در ژنوم یوکاریوتها بیشتر یافت میشوند. ریزماهوارهها به صورت طبیعی در نواحی غیر کدکننده DNA از قبیل اینترونها و تـوالیهای بین ژنی دیده میشوند. ریـز مـاهوارهها معمولاً نـزدیک بـه SINEs22 و LINEs23 ها و نزدیک به عناصر شبه رتروترانسپوزونها دیده میشوند (25). ریزماهوارهها به نواحی کدکننده ژنوم نیز متصل
شدهاند (18). ریزماهوارهها در نقشهیابی ژنومی، انگشتنگاری DNA، سازماندهی ژرمپلاسم و مطالعات سیتوژنتیکی و ارزیابی تنوع ژنتیکی درون جمعیتها استفاده میشوند (12). ریزماهوارهها به دلیل همبارز بودن و تبعیت از توراث مندلی و تشخیص آسان افراد هموزیگوس از هتروزیگوسی در بررسی تنوع ژنتیکی و انتخاب والدین برتر استفاده میشوند (56). نشانگر SSR به دلیل همبارز بودن و سطح بالای چندشکلی و کاربرد آسان این تکنیک، یک روش مناسب برای بررسی تنوع ژنتیکی به حساب میآید(18).
1-12-3-2-4 نشانگرISSR24:
زیتکیویز و همکاران در سال 1994 نشانگر مولکولی جدیدی (مبتنی بر PCR) به نام ISSR را معرفی کردند(76). این تکنیک شامل تکثیر قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثیر بین دو توالی تکراری ریزماهواره است که در دو جهت مختلف آرایش یافتهاند. در این نشانگرها معمولاً از ریز ماهوارههایی با طول 25-16 جفت باز به عنوان آغازگرهایی که در یک واکنش PCR مکانهای ژنومی زیادی را مورد هدف قرار میدهند استفاده میکنند و به دلیل طویل بودن آغازگرها، تکرارپذیری بالایی دارند، همچنین طول قطعات تکثیری با هم متفاوت میباشند. تکرارهای ریزماهواره که به عنوان آغازگر استفاده میشوند، اصولاً دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی میباشند. این آغازگرها می توانند بدون باز اضافه (55،33و25) یا دارای 1 تا 4 باز اضافی به صورت لنگر در انتهای ´3 یا ´5 باشند (76). نشانگرISSR تصادفی بوده و تکرارپذیری و چندشکلی بالایی دارد و در طیف وسیع از گیاهان استفاده میشود. میزان تکرارپذیری در نشانگر ISSR بین 95-92 درصد است. بخصوص زمانی که از ژل پلیاکریلآمید استفاده گردد. این تکنیک نیازمند اطلاعات اولیه در مورد توالی ژنوم نیست و الگوی چندشکلی زیاد و چند لوکوسی ایجاد مینماید. میزان DNA مورد استفاده در این تکنیک بسته به نوع گیاه متفاوت و در حدود 10 تا50 نانوگرم میباشد (43). نشانگرهای ISSR، اغلب به عنوان نشانگرهای غالب معرفی میشوند که از قوانین توارث مندلی تبعیت میکنند (66،56 و 25).
1-12-3-2-5 نشانگرSRAP25:
لی و کویروس در سال 2001 برای اولین بار نشانگر مولکولی جدیدی به نام SRAP را معرفی کردند(34). SRAP، تکنیک نشانگر تقریبا جدیدی است که توالی کددهنده ژنوم را توسط پرایمرهای 17 تا 19 نوکلئوتیدی هدفگیری می کند (40) که به خصوص برای تکثیر توالی (Open Reading Frame) ORF مورد استفاده قرار میگیرد و بر مبنای 2 پرایمر تکثیرکننده میباشد (55) . این سیستم نشانگر حتی قابلیت تشخیص میزان بالائی از پلیمورفیسم را نیز در بین گونهها دارد (47).
مارکرهای SRAP تمام ویژگیهای یک مارکر مولکولی مناسب را از قبیل همبارز بودن دارد یعنی می تواند هوموزیگوتها را از هتروزیگوت ها تشخیص دهد (35). پرایمر forword دارای 17 جفت نوکلوئید است که 14 نوکلوئید آن ثابت و غنی ازG,C است و3 نوکلئوتید متغیر آن در انتهای /3 قرار دارد. این پرایمر ترجیحا ناحیه اگزون را تقویت میکند (ناحیه اگزون غنی از G,C است). پرایمر Reverse دارای 19 جفت نوکلئوتید است که 16 نوکلئوتید آن ثابت و غنی ازA,T است و3 نوکلئوتید متغیر آن در انتهای /3 قرار دارد. این پرایمر ترجیحا ناحیه اینترونها وپروموتورها را تقویت میکند (35). پلی مورفیسم اساساً از تنوع طول این اینترونها وپروموتورها و فاصلهها، ایجاد میشود. 3 نوکلئوتید متغیر انتهایی SRAP میتواند بر طبق طراحی ترکیبات مختلف پرایمری تغییر کنند. جفت پرایمرها میتوانند با ترکیب پرایمر forword و reverse ترکیبات جدیدی را ایجاد کنند که هزینه



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید