معاونت پژوهش و فناوری
فرم منشور اخلاق پژوهش
اینجانب مریم حاجی حسینی دانشجوی رشته زیست‏شناسی گرایش میکروبیولوژی تعهد می نمایم که اصول زیر را در انجام پایان نامه مدنظر قرار داده ام.
1- اصل برائت: التزام به برائت جویی از هرگونه رفتار غیرحرفه ای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبه های غیرعلمی می آلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب داری غیرعلمی و حفاظت از اموال، تجهیزات و منابع دراختیار.
3- اصل ترویج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعایت حریم ها و حرمت ها در انجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری از هرگونه حرمت شکنی.
5- اصل رعایت حقوق: التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان،حیوان، نبات) و سایر صاحبان حق.
6-اصل راز داری: تعهد به صیانت از اسرار واطلاعات محرمانه افراد، سازمان ها و کشور و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی: تلاش در راستای پی جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هرگونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی و معنوی: تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی: تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظرداشتن پیشبرد و توسعه کشور در کلیه مراحل پژوهش.
محل امضاء و تاریخ
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده علوم پایه
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‏شناسی
گرایش میکروبیولوژی
عنوان
بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM و blaNDM در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهران
استاد راهنما
دکتر رضا میرنژاد
نگارنده
مریم حاجی حسینی
دی‏ماه 93
یَرفَعُ اللهَ الذیِنَ آمَنوُا مِنکُم وَ الذیِنَ اوُتوالعِلم دَرَجَات
« قرآن کریم »
تصـویب نامــه
پایان نامه کارشناسی ارشد خانم مریم حاجی حسینی
با عنوان بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای blaVIM و blaNDM در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهران
در جلسه مـورخ ………………………………… تحت نظارت شـورای پایان نامـه متشکل از اسـتادان زیر با درجه …………………………….. و نمره ……………………….. مورد تأیید قرار گرفت .
1- استاد راهنما : دکتر رضا میرنژاد امضاء
2- استاد داورداخل گروه: …………………………………………………… امضاء
3- استاد داورخارج گروه:……………………………………………………. امضاء
دکتر شهرام رضوان بیدختی
معاون پژوهش و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
تاریخ ………………… امضاء ………………..
سپاس بی کران پروردگار یکتا را که هستی مان بخشید و به طریق علم و دانش راهنمایمان شد و به هم نشینی رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه چینی از علم و معرفت را روزیمان ساخت.
با تقدیر و تشکر شایسته از استاد فرهیخته آقای دکتر رضا میرنژاد که با نکته های دلاویز و گفته های بلند ، صحیفه های سخن را علم پرور نمود و همواره راهنما و راه گشای نگارنده در اتمام واکمال پایان نامه بوده است
وبا تقدیر و درود فراوان خدمت پدر و مادر بسیار عزیز ، دلسوز و فداکارم که پیوسته
جرعه نوش جام تعیلم و تربیت ، فضیلت و انسانیت آنها بوده ام و همواره چراغ وجودشان
روشنگر راه من در سختی ها و مشکلات بوده است
و در اخر تشکر می کنم از همسرم، که در سایه همیاری و همدلی او به این منظور دست یافتم.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده1
فصل اول – مقدمه
1-1- بیان مسأله2
1-2- ضرورت انجام تحقیق3
1-3-اهداف پژوهش4
1-4-فرضیه‏ها4
1-5-تعریف متغیرها4
فصل دوم – مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی6
2-2- تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی7
2-3- شناسایی گونه های اسینتوباکتر7
2-4- جایگاه طبیعی اسینتوباکتر بومانی8
2-5.فاکتورهای بیماری زایی اسینتوباکتر8
2-6.منشا کلینیکی عفونت های اسینتوباکتر بومانی10
2-6-1.مننژیت10
2-6-2.عفونت خون10
2-6-3.عفونت های دستگاه ادراری10
2-6-4. پنومونی بیمارستانی10
2-7. عفونت های بیمارستانی11
2-8. استراتژی های درمانی عفونت های اسینتوباکتر بومانی12
2-9. داروهای ضد میکروبی رایج12
2-9-1. پلی میکسین ها13
2-9-2.آمینوگلیکوزیدها13
2-9-3.سولباکتام14
2-9-4. کینولون ها14
2-9-5.تتراسایکلین ها و تایگلیسین ها15
2-9-6.آنتی بیوتیک های بتالاکتام15
2-9-6-1.پنی سیلین ها15
2-9-6-2.کارباپنم ها17
2-9-6-3.سفالوسپورین ها17
2-9-6-4. مونوباکتام ها18
2-9-7.دیگر درمان های ترکیبی18
2-10.مکانیسم عمل آنتی بیوتیک های بتالاکتام18
2-10-1.پنی سیلین ها18
2-10-2.کارباپنم ها19
2-10-3.سفالوسپورین ها19
2-11.مکانیسم های مقاومت20
2-11-1.مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی20
2-11-2.مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها21
2-11-2-1. مکانیسم های آنزیمی21
2-11-2-2.مکانیسم های غیر آنزیمی21
2-12.طبقه بندی بتالاکتامازها22
2-13.بتالاکتامازهای باکتری های گرم منفی24
2-14.بتالاکتامازهای باکتری های گرم مثبت24
2-15.بتالاکتامازهای وسیع الطیف24
2-16.خصوصیات آنتی بیوتیک های وسیع الطیف25
2-17.حساسیت ESBL ها در مقابل آنتی بیوتیک ها25
2-18.انواعESBL ها26
2-18-1.بتالاکتامازهای تیپ SHV26
2-18-2.بتالاکتامازهای تیپ TEM26
2-18-3.بتالاکتامازهای تیپ OXA27
2–18-4.بتالاکتامازهای تیپCTX-M27
2-18-5. بتالاکتامازهای تیپ NDM(متالوبتالاکتاماز)27
2-18-6.بتالاکتامازهای تیپ VIM(متالوبتالاکتاماز)28
2-19. فاکتور هایی که بر بیان بتالاکتامازها اثر می گذارند28
2-20.درمان عفونت های ایجاد شده توسط سویه های مولد ESBL29
2-21.کنترل30
2-22.مثال هایی از مکانیسم های مقاومت به بتالاکتام ها30
2-22-1.مکانیسم مقاومت به کارباپنم ها30
2-22-2.مکانیسم مقاومت به پنی سیلین ها31
2-22-3.مکانیسم مقاومت به مونوباکتام ها32
2-22-4.مقاومت به آمینوگلیکوزیدها32
2-22-5. مقاومت به پلی میکسین ها33
2-22-6.مقاومت به کینولون ها33
2-22-7.مقاومت به تتراسایکلین ها و تایگلسین ها33
2-23.مهارکنندگان بتالاکتامازها34
2-23-1.مکانیسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها34
2-24.روش های شناسایی آنزیم های ESBL35
2-24-1-1.آزمایش مجاورت دو دیسک35
2-24-1-2.ترکیب دو دیسک36
2-24-1-3.آزمایش سه بعدی36
2-25.شیوع بیمارستانی و ارزیابی میزان کنترل36
2-26.اپیدمیولوژی جهانی اسینتوباکتر بومانی37
2-27. روش مولکولی دخیل در بررسی باکتری های مولد آنزیم های بتالاکتاماز وسیع الطیف38
2-27-1. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)39
2-28.سوابق و پیشینه تحقیق41
فصل سوم – مواد و روش‏ها
3-1-وسایل موردنیاز37
3-2-مواد موردنیاز38
3-3-طریقه ساخت محیط های کشت40
3-3-1.طرز تهیه محیط بلاد آگار(محیط پایه شرکت Merck )40
3-3-2. طرز تهیه محیط نوترینت آگار (شرکت Merck)40
3-3-3. طرز تهیه محیط SIM(شرکت Merck )41
3-3-4. طرز تهیه محیط مک کانکی آگار(شرکت Merck )41
3-3-5. طرز تهیه محیط اوره براث(شرکت Merck )42
3-3-6. طرز تهیه محیط مولر هینتون آگار(شرکت Merck ):………………..42
3-3-7. طرز تهیه محیط MRVP(شرکت Merck )……………….52
3-3-8. طرز تهیه محیط BHI براث(شرکت Merck)52
3-3-9. طرز تهیه محیط TSI(شرکت Merck ):53
3-3-10. طرز تهیه محیط سیمون سیترات (شرکت Merck )54
3-3-11. طرز تهیه محیط OF(شرکت Merck ):………………………………………………………………………………54
3-4. روش انجام این پژوهش55
3-4-1.جمع آوری نمونه55
3-4-2.جداسازی باکتری ها55
3-4-3. نگه داری باکتری ها در 80- درجه سلسیوس57
3-5.آنتی بیوگرام57
3-5-1-تهیه سوسپانسیون باکتریایی………………………..57
3-5-2-روش آنتی بیوگرام58
3-6.استخراج ژنوم به روش جوشاندن59
3-7. اندازه گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده59
3-8. الکتروفورز محصول استخراج ژنوم59
3-9.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای PCR59
3-9-1.DNA الگو59
3-9-2.Master Mix60
3-9-3.پرایمر60
3-9-4.محلول کار پرایمر PCR61
3-10.روش اجرا PCR61
3-11.مواد و وسایل مورد نیاز برای اجرای الکتروفورز63
3-11-1.بافرTBE 5X63
3-11-2.بافر TBE 1X63
3-11-3.ژل آگارز 5/1 درصد63
3-12.روش انجام الکتروفورز64
3-13.تعیین توالی64
فصل چهارم – نتایج و بحث
4-1.جداسازی، کشت، تشخیص نمونه های باکتری65
4-1-1. درصدو تعداد گونه های مختلف موجود در نمونه های جدا شده از بیماران65
4-1-2. نتایج تست های افتراقی برای گونه های اسینتوباکتر بومانی67
4-1-3. تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن67
4-1-3-1.نتایج حاصل از روش دیسک دیفیوژن برای تمام ایزوله های اسینتوباکتر بومانی67
4-1-3-2. تهیه الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی69
4-2.استخراج DNA72
4-3.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کد کننده آنزیمblaVIM73
4-4.نتایج بدست آمده در بررسی ژن کدکننده آنزیم blaNDM74
4-5:.بحث76
فصل پنجم – نتیجه‏گیری
5-1- نتیجه‏گیری80
5-2-پیشنهادات82
منابع83
چکیده انگلیسی94
فهرست جدول‏ها
عنوان صفحه
جدول2-1:طبقه بندی بتالاکتامازها در باکتری های گرم منفی23
جدول شماره 3-1: ترکیبات پایه ی محیط بلاد آگار49
جدول شماره 3-2: ترکیبات محیط نوترینت آگار49
جدول شماره 3-3: ترکیبات محیط SIM50
جدول شماره 3-4: ترکیبات محیط مک کانکی آگار50
جدول شماره 3-5: ترکیبات محیط اوره براث51
جدول شماره 3-6: ترکیبات محیط مولر هینتون آگار51
جدول شماره 3-7: ترکیبات محیط MRVP52
جدول شماره 3-8: ترکیبات محیط BHI براث52
جدول جدول شماره 3-9: ترکیبات محیط TSI53
جدول جدول شماره 3-10: ترکیبات محیط سیمون سیترات54
جدول شماره 3-11: ترکیبات محیط OF55
جدول شماره 3-12:خلاصه نتایج حاصل از محیطOF56
جدول شماره3-13:توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه60
جدول شماره 3-14: محلول کاری پرایمر61
جدول شماره3-15: ترکیب واکنش PCR برای هر نمونه62
جدول شماره3-16: برنامه انجام واکنش PCR برای ژن VIM62
جدول شماره 3-17 برنامه انجام واکنش PCR برای ژن NDM62
جدول شماره3-18: طرز تهیه بافر TBE 5X63
جدول شماره 4-1 : فراوانی اسینتوباکتر بومانی در نمونه کلینیکی مورد بررسی66
جدول شماره 4-2: خصوصیات بیو شیمیایی اسینتوباکتر بومانی67
جدول شماره 4-3: نتایج حساسیت اسینتوباکتر بومانی به دیسک های آنتی بیوتیکی در نمونه های کلینیکی مورد بررسی68
جدول شماره 4-4 : الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در اسینتوباکتر بومانی70
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار شماره 4-1: فراوانی سویه های اسینتوباکتر در نمونه های کلینیکی مورد بررسی66
نمودار شماره 4-2 : درصد مقاومت مشاهده شده در بین ایزوله های جدا شده از بیماران69
نمودار شماره4-3: درصد فراوانی ژن های VIM,NDMمورد مطالعه در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران75
فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
شکل 4-1: بررسی کیفی .الکتروفورز نمونه‌هاي DNA استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 172
شکل 4-2: بررسی کمی. نتایج اندازه گیری غلظت DNA استخراجی با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ در طول موج 260 نانومتر72
شکل شماره 4-3: الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فایل شده ی ژن blaVIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR73
شکل شماره 4-4 :الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلی فای شده ی ژن blaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با PCR
چکیده:
مقدمه : در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد. این باکتری با مکانیسم های مختلف از جمله تولید بتالاکتامازها به این داروها مقاومت نشان می دهند. متالوبتالاکتاماز دارای تیپ های مختلفی می باشند که که در بین آنها blaVIM و blaNDMاز همه بارزتر است .با توجه به اینکه در شهر تهران میزان فراوانی ژن فوق در اسینتوباکتر بومانی مشخص نمی باشد این مطالعه با هدف بررسی مقاومت دارویی و فراوانی ژنهای هایblaVIM و blaNDM در اسینتوباکتر بومانی های ایزوله شده از بیماران شهر تهران به روش مولکولی اجرا گردید.
روش کار: این مطالعه برروی 500 نمونه بالینی جمع آوری شده از 3 بیمارستان شهر تهران طی مدت دو سال انجام گردید. پس از جمع آوری نمونه ها با استفاده از روش های کشت و بیوشیمیایی گونه اسینتوباکتر بومانی شناسائی گردید. سپس تست حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی این ایزوله ها با روش دیسک دیفیوژن بر اساس دستور CLSI انجام گردید. در نهایت برای بررسی فراوانی ژن های blaVIM و blaNDM با استفاده از پرایمرهای اختصاصی PCR انجام شد.
نتایج: با توجه به نتایج غربالگری اولیه، بیشترین مقاومت آنتی بیوتیکی در 100 ایزوله اسینتوباکتر بومانی مربوط به آنتی بیوتیک های سفی پیم و کمترین مقاومت مربوط به پلی میکسین B بدست آمد. نتایج PCR نشان داد که به ترتیب 17% و 20%، سویه ها حامل ژن های blaVIM و blaNDMمی باشند.
بحث: این مطالعه نشان داد که ژنهای کدکننده blaVIM و blaNDMدر حال گسترش در بین سویه های بالینی اسینتوباکتر بومانی بوده، لذا شناسایی ژنهای فوق با استفاده از روش مولکولیPCR که روشی سریع و مقرون به صرفه است برای جلوگیری از انتشار عفونت در بیمارستان های شهر تهران پیشنهاد می شود.
کلمات کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، بتالاکتامازهای وسیع الطیف، دیسک ترکیبی، VIM، NDM، PCR
فصل اول
مقدمه
1-1-بیان مسئله
اسینتوباکتربومانی از پاتوژن های فرصت طلب در حال گسترش بوده، این باکتری یک باسیل گرم منفی، غیر متحرک، غیر تخمیری، پلی مورف، هوازی اجباری و معمولا کپسول دار است که بر روی محیط های معمولی آزمایشگاهی به آسانی رشد می کند . اندازه کلنی بین 1 تا 2 میلی متر، بدون پیگمان و صاف تا موکوئیدی است. در مرحله رشد لگاریتمی شکل باسیل دارند، ولی در مرحله سکون به صورت کوکوباسیل دیده می شوند اسینتوباکتر بومانی اکسیداز منفی هستند، توانایی احیای نیترات را ندارند، همچنین اندول منفی و کاتالاز مثبت می باشند. بر روی محیط آگار خون دار معمولا همولیز ایجاد می کنند و در دمای 44 درجه سلسیوس رشد می کنند.
این باکتری ها در روی سطوح خشک تا مدت ها زنده باقی می مانند. مقاومت بالای این باکتری نسبت به شرایط محیطی (11روز در رطوبت نسبی 31 درصد، 4 روز در رطوبت نسبی 10 درصد) امکان حضور این باکتری را در محیط های بیمارستانی افزایش داده است. این ارگانیسم به عنوان فلور نرمال در پوست و دستگاه تنفسی افراد سالم وجود داشته و در سال های اخیر به عنوان یک عامل مهم در عفونت های بیمارستانی گزارش شده است. با وجود اینکه این باکتری معمولا از ویرولانس پائینی برخوردار است، اما می تواند طیف وسیعی از عفونت ها نظیر باکتریمی، سپتی سمی و پنومونی همچنین عفونت خون در بیماران دچار سوختگی با ضعف سیستم ایمنی را ایجاد نماید. اسینتوباکتر بومانی بیشترین عامل ایجاد کننده عفونتهای بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه می باشند که نسبت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها مقاومت نشان می دهند. اگرچه سویه های اسینتوباکتر بومانی معمولا در آب و خاک یافت می شوند، ولی منشا سویه های اپیدمیک مقاومت به چند دارویی آن از بیمارستان می باشد و این سویه ها از لحاظ ژنتیکی بسیار شبیه هم هستند. ریسک فاکتورهای مهم آن مصرف طولانی مدت آنتی بیوتیک، اقامت طولانی در بخش مراقبت های ویژه (ICU) و بیماری های جدی می باشد.
اسینتوباکتر بومانی به عوامل ضد میکروبی بسیار مقاوم است که این مقاومت می تواند ذاتی و یا از طریق بدست آوردن عوامل ژنتیکی مقاومت باشد. درمان عفونت های اسینتوباکتر اغلب در مواردی که فنوتیپ مقاومت، چند دارویی است مشکل می باشد. این مقاومت ها اغلب با واسطه ژن هائی صورت می گیرد که بر روی عناصر ژنتیکی متحرک مثل ترانسپوزون ها و اینتگرون ها قرار داشته و به سادگی در میان باکتری ها انتشار می یابند. در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروی انتخابی در درمان عفونت های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو استفاده می گردد، هرچند مقاومت به این عوامل رو به افزایش می باشد.
این باکتری با مکانیسم های مختلف به این داروها مقاومت نشان می دهند که می توان به موارد زیراشاره کرد. یکی از این عوامل ایجاد کننده مقاومت تولید متالوبتالاکتاماز می باشد. متالوبتالاکتامازها قادر به هيدروليز طيف وسيعی از بتالاکتام ها از جمله پنی سيلين ها، سفالوسپورين ها و کارباپنم ها هستند، اما توانايی هيدروليز مونوباکتام ها (آزترونام) را ندارند. متالوبتالاکتاماز بر اساس ساختار مولکولی به شش نوع تقسيم می شود که شامل ژنهای:AIM,NDM ,SPM ,SIM ,GIM ,IMP ,VIM هستند که در بين آنها VIM و NDM از همه بارزتر می باشد .
1-2.ضرورت اجرای تحقیق:
شیوع وگسترش عفونت هاي بيمارستاني ازعلل شايع و مهم مرگ و مير، ناتواني، افزايش طول مدت بستري، تحميل وافزايش هزينه هاي بيمارستاني و بروزمشکلات بهداشتي مي باشند. اسينتوباكترهاي مقاوم به چنددارو مشكلات درماني دردنيا ايجاد نموده اند و دركشورايران نيزيك مشكل نوظهور مي باشند.
در تحقیقات به عمل آمده به ویژه درایران ، به حضور blaVIM و blaNDM که منجر به نتایج منفی کاذب می گردند، کمتر اشاره شده است بنابراین ضروری است که برای شناسایی دقیق این نوع مقاومت از روش های مولکولی در کنار روش های فنوتیپی استفاده کنیم
1-3.اهداف پژوهش:
تعیین میزان مقاومت داروئی و میزان شیوع ژنهای blaVIM و blaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی ایزوله شده از بیماران شهر تهران در سال 1392 با روش مولکولی PCR.
اهداف فرعی:
تعیین الگوی مقاومت دارویی در ایزوله های جدا شده اسینتوباکتر بومانی با روش دیسک دیفیوژن
شناسایی ژن مقاومتblaVIM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با روش PCR
شناسایی ژن مقاومتblaNDM در سویه های اسینتوباکتر بومانی با روش PCR
1-4.سوالات فرضیه:
آیا ژن های کدکننده بتالاکتامازها در اسینتوباکتر بومانی وجود دارند و از طرفی اگر ژن های کد کننده بتالاکتامازها در اسینتوباکتر بومانی وجود دارند میزان شیوع آن ها چقدر است؟
1-5.تعریف متغیرها:
اسینتوباکتر بومانی:
این باکتری پاتوژن فرصت طلب، کوکوباسیل، گرم منفی، هوازی اجباری، غیر تخمیر کننده، غیر متحرک، اکسیداز منفی، کاتالاز مثبت می باشد. بر پایه طبقه بندی جدید در خانواده Moraxelaceae در راسته Gammaproteobacteria قرار می گیرد. اسینتوباکتر بومانی که به بیش تر آنتی بیوتیک ها مقاوم می باشد سبب ایجاد عفونت ادراری، مننژیت، پنومونی و عامل اصلی عفونت بیمارستانی مخصوصا در بیماران بستری در بخش مراقبت های ویژه می باشد.
بتالاکتامازهای وسیع الطیف:
بتالاکتام ها دسته ای از آنتی بیوتیک ها(پنی سیلین، سفالوسپورین، مونوباکتام و کارباپنم) هستند که از سنتز دیواره سلولی با اتصال آنزیم های دخالت کننده در تولید پپتیدوگلیکان یعنی، پروتئین های متصل شونده به پنی سیلین جلوگیری کرده و تحت تاثیر آنزیم های بتالاکتاماز، حلقه ی آسیل آن ها هیدرولیز می شود.
PCR:
از مهمترین و تاثیر گذارترین تکنیک های ابداع شده در زیست شناسی و پزشکی می باشد، این روش در واقع تکثیرDNA به شکل مصنوعی می باشد. استفاده از PCR برای تشخیص سویه های حامل ژن های کدکننده آنزیم های بتالاکتامازی، مزایای بسیاری دارد که شامل حساسیت زیاد آن در تشخیص الگوهای هدف، سرعت بالا و نتایج قابل اعتماد آن به دلیل اختصاصی بودن فوق العاده آن می باشد.
NDM:
blaNDM یک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش میباشد. در سال 2009 در دهلی نو گزارش شده است و از آن زمان به بعد به طور گسترده ای در انگلستان و آسیای جنوب شرقی منتشر شده است. در حال حاضر ژن blaNDMدر طیف وسیعی از باکتری های گرم منفی در محیط زیست دهلی نو از جمله در پاتوژن های جدی شیگلا و ویبریوکلرا به طور گسترده ای شناسایی شده است.آنزیم blaNDMباعث می گردد باکتری به آنتی بیوتیک های بتالاکتام به استثناء آزترونام مقاومت نشان می دهد.
VIM:
blaVIMیک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش می باشد. اولین سویه ی حاوی ژن blaVIM نیز در ایتالیا در سال 1997 مشاهده شد. باکتری های دارای ژن blaVIM قادر به هیدرولیز طیف وسیعی از بتالاکتام ها از جمله پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها و کارباپنم ها هستند، اما توانایی هیدرولیز مونوباکتام(آزترونام)را ندارند.

فصل دوم
مروری برتحقیقات انجام شده
2-1.تاریخچه جنس اسینتوباکتر بومانی:
اوایل قرن 20 در سال 1911 میلادی میکروبیولوژیست آلمانی بنام بیجرینگ 1 ارگانیسمی بنام Calcoaceticus micrococcus را از خاک جدا کرد(.طی دهه های بعد ارگانیسم های مشابهی توصیف شدند که شامل 15 گونه و جنس متفاوت بودند که می توان از آنها نام برد( پلگ2 و همکاران،2008) :
Herellea vaginicol ،Niesseria winogradskyi ،Acromobacter anitratus,
Bacterium anitratum ،Alcaligenes heamolysans ،Diplococcus mucosus,
Micrococcus calcoaceticus، Mima polymorpHa ،Achromobacter mucosus,
Akinetos نام یونانی جنس رایج اسینتوباکتر می باشد که به معنی غیر متحرک می باشد که درسال 1954 توسط بریشو3و پریوت 4 برای جدا کردن میکروارگانیسم های غیر متحرک از متحرک های جنس آکروموباکتر به کار گرفته شد.
2-2.تاکسونومی رایج اسینتوباکتر بومانی:
اسینتوباکتر(5A) کوکوباسیل گرم منفی است که اخیرا در خانواده جدید Moraxelaceae و راسته Gammaproteobacteria قرار می گیرند(روساو و همکاران6، 1991).
در سال 1986 مطالعاتی بر پایه هیبریداسیون DNA-DNA انجام شد که از 12 گروه DNA 2سویه اصلی A. baumannii, A. calcoaceticus تشخیص داده شد(بویووت و گریمونت7 1986).
همچنین به تدریج از گیاهانی که در فاضلاب بودند و به صورت لجن درآمده بودند 7 گونه جدا شد که به آن اشاره شده( کار و همکاران 8، 2007) :
A. Tandoii, A. grimonti, A. galcoaceticus, A. gerneri, A.bouvetti,
A. baylyi, A. Towneri, A.tjerbergiae, A. baumanni ,
2-3.شناسایی گونه های اسینتوباکتر:
اسینتوباکترها بصورت کوکوباسیل و گرم منفی بوده ولی رنگ آمیزی بسیار سختی دارند به همین دلیل گاهی اشتباها این باکتری بصورت کوکسی گرم منفی و یا گرم مثبت دیده می شود. برای نگهداری اسینتوباکتر با منشا انسانی می توان از محیط کشت بلاد آگار تهیه شده با خون گوسفندی استفاده کرد. بیشتر گونه های اسینتوباکتر کلنی های مات و کوچکی دارند به جزء کلنی های A.baumanni , A. calcoaceticus که مشابه کلنی انتروباکتریاسه 3-5/1میلی متر قطر دارند.سویه اسینتوباکتر همولیتیکوس و چندین سویه ی دیگر که در حال حاضر به خوبی مشخص شده اند نظیر اسینتوباکتر بیوتیپ 13, BJ14, BJ15 16و17ممکن است بر روی محیط بلاد آگار تهیه شده توسط خون گوسفندی تولید همولیز کنند که این خصوصیت به هیچ عنوان در اسینتوباکترهایی که متعلق به کمپلکس A.baumanni ،A.calcoaceticus هستند مشاهده نشد.
متاسفانه هیچ تست متابولیکی که تنها برای تشخیص اسینتوباکتر از دیگر باکتری های گرم منفی غیر تخمیری به کار گرفته شود وجود ندارد. استفاده از محیط کشت غنی شده با pH پایین که به شدت هوادهی شده و سرشار از ذخایر معدنی همراه با استات و یا دیگر منابع مناسب کربن و نیترات به عنوان منبع نیتروژن می تواند روش مناسبی برای شناسایی بدون ابهام اسینتوباکتر از نمونه های محیطی و کلینیکی باشد.
استفاده از محیط کشت اسینتوباکتر جزء آسان ترین روش های شناسایی اسینتوباکتر از یک جمعیت باکتریایی مخلوط می باشد، ولی هیبریداسیون DNA-DNA به عنوان یک روش استاندارد بکار گرفته می شود(پلگ و همکاران، 2008).
2-4.جایگاه طبیعی اسینتوباکتر بومانی:
اسینتوباکتر بومانی جزء باکتری هایی هستند که از تمام نمونه های جمع آوری شده از خاک و سطح آب قابل جداسازی می باشند در نتیجه می توان گفت در همه جا حضور دارند. بیشتر گونه های اسینتوباکتر که از نمونه های کلینیکی انسانی جدا شده اند حداقل یک سری از ویژگی ها را به عنوان پاتوژن های انسانی دارا هستند.در بررسی های اپیدمیولوژی که بر روی پوست و اعضای موکوئیدی انسان انجام شد 43% از افرادی که در بیمارستان بستری نبودند، حامل این باکتری بر روی پوست خود بودند که نشان می دهد این باکتری جزئی از فلور نرمال پوست انسان می باشد که بیش ترین گونه های یافت شده، اسینتوباکترلوفی، اسینتوباکتر جانسونی، اسینتوباکتر جونی و اسینتوباکتر بیوتیپ 3 بود (پلگ و همکاران ،2008). و این در صد در افرادی که در بیمارستان ها بستری شده اند به 75% و حتی بالاتر هم رسیده است ( برلو و همکاران 9، 1999 ).
برلو سبزیجات انگلستان را مورد آزمایش قرار داد و دریافت که از 177 نمونه سبزیجات آزمایش شده، کشت 30 نمونه (17%) از نظر وجود اسینتوباکتر مثبت بوده، همچنین اسینتوباکتر بومانی و اسینتوباکتر بیوتیپ11 در این میان شایع ترین گونه ها بودند( برلو و همکاران ،1999). میزان انتقال اسینتوباکتر بصورت مدفوعی مورد مطالعه قرار گرفت و نشان داده شد که 25% افراد سالم بصورت ناقل هستند که از همه مهمتر اسینتوباکتر جانسونی و اسینتوباکتر بیوتیپ 11 می باشد (پلگ و همکاران ،2008 ).

2-5.فاکتورهای بیماری زایی اسینتوباکتر:
در مورد فاکتورهای بیماریزایی اسینتوباکتر اطلاعات کمی در دسترس بوده است، ولی اخیرا اطلاعاتی نظیر بدست آوردن تعیین توالی ژنوم اسینتوباکتر به ما کمک می کند تا جزایر پاتوژنیستی و آرایش مقاومت دارویی اسینتوباکتر بومانی را مشخص کنیم.
در ارتباط با تعدادی از ژن های مشخص شده که مقاومت آنتی بیوتیکی، مقاومت فلزات سنگین و آنتی سپتیک را کد می کردند پاتوژن های دیگری نظیر سودوموناس، سالمونلا و اشریشیاکلی وجود دارند که نشان دهنده ی این است که انتقال ژنتیکی عوامل ویرولانس نیز امکان پذیر می باشد.
پس از انجام دادن چندین موتاسیون تصادفی در سویه ی ATCC اسینتوباکتر بومانی Smit توانست چندین موتانت را در جزیره پاتوژنیسیته متفاوت، با ویرولانس خفیف توسط مدل های Gaenohabtidis elegans و Dictyostelium که مدل های غیر پستانداران بودند مشخص کند.
ژن موتاسیون یافته مربوط به فاکتورهای رونویسی، سیستم های انتقال چند دارو به خارج و اوره آز بودند. متاسفانه ویرولانس این موتانت ها در مدل های پستانداران بررسی و پیاده نشد. وقتی ژنوم اسینتوباکتر بومانی با ژنوم A.baylyi که بیماری زا می باشد مقایسه شد مشخص گردید که 28 دسته ی ژنی در آن وجود دارد که تنها مختص به اسینتوباکتر بومانی می باشد که 16 تا از این ژن ها توانایی ایجاد تهاجم و بیماری زایی را داشتند.
یکی از جالب ترین آنها یک جزیره ی 133740 جفت بازی بود که نه تنها حاوی ترانسپوزون ها و اینتگرازها بود بلکه واجد ژن هایی بود که مشابه سیستم ویرولانسی، ترشحی تیپ IV در Legionella/Coxiella بود.(توماراس و همکاران10،2003)
دیگر ژن ها شامل آن هایی بود که در تشکیل پوشش سلولی، بیوژنز پیلوس، جذب و متابولیسم آهن نقش داشتند. مطالعات بیشتری که بر روی مکانیسم های اختصاصی بیماری زایی در اسینتوباکتر بومانی صورت گرفت بر روی سیستم اکتساب آهن بر پایه ی سیدروفورها و شکل گیری بیوفیلم ها و پیوستگی و عملکرد OMP و LPS اسینتوباکتر بومانی متمرکز بود. توانایی اسینتوباکتر بومانی برای چسبیدن به سطوح و تشکیل بیوفیلم ها بر روی اجسام بی جان علت پایداری این ارگانیسم ها در محیط بیمارستان بود.توماراس نشان داد که شکل گیری بیوفیلم در اسینتوباکتر بومانی به طور فنوتیپی همراه با شکل گیری پیلوس و تولید اگزوپلی ساکارید بود.
آنالیز بیشتر توالی ها مشخص کرد، اپرون پلی سیسترونیک Csu شامل 5ژن است که شبیه ژن هایی می باشد که پروتئین های مربوط به چاپرون و همچنین پروتئین هایی را که در تجمع پیلوس در دیگر باکتری های گرم منفی نقش دارد را کد می کند. چسبندگی اسینتوباکتر بومانی به سلول های اپیتلیال برونش انسان و گلبول های قرمز به علت وجود ساختاری شبه پیلوس بوده که در ایجاد این چسبندگی نقش دارد.
اسینتوباکتر بومانی پس از اتصال به سلول های انسان، می تواند باعث تحریک خودکشی سلول توسط OMP شود.این پروتئین در میتوکندری تجمع پیدا کرده و منجر به خودکشی سلول از دو مسیر وابسته به کاسپاز و مسیر مستقل می شود.
2-6.منشا کلینیکی عفونت های اسینتوباکتر بومانی:
2-6-1.مننژیت:
مننژیت جزء بیماریی هایی محسوب می شود که بیشتر توسط پاتوژن های گرم منفی اتفاق می افتد که اسینتوباکتر بومانی جزء این پاتوژن ها می باشد و باعث 70% مرگ و میر می شود (متان و همکاران11 ، 2007 )

2-6-2.عفونت خون:
در طی سال های 1995 تا 2002 مطالعاتی که بر روی عفونت های بیمارستانی در آمریکا انجام شد نشان داد اسینتوباکتر بومانی مسئول 3/1% تمام عفونت های تک میکروبی بیمارستانی در محیط خون بوده که جزء دهمین عامل رایج امراض محسوب می شود.
اسینتوباکتر بومانی باعث ایجاد 6/1% عفونت های خونی در بخش مراقبت های ویژه12) ( ICU است ولی در محیط خارج از ICU 9/0% باعث ایجاد عفونت های خونی می شود. میزان مرگ ومیر ایجاد شده توسط اسینتوباکتر بومانی در محیط خون 34 تا 4/43% در ICU و3/16% در محیط خارج از ICU بود.
اسینتوباکتر بومانی تقریبا 26 روز پس از بستری شدن عفونت های خونی ایجاد می کند و سودوموناس آئروژینوزا و کاندیدا رتبه ی بالای مرگ و میر را در محیط ICU دارا می باشند (ویسپیلینگوف و همکاران13- ،2003)
2-6-3.عفونت های دستگاه ادراری:
اسینتوباکتر بومانی یکی از عوامل فرعی ایجاد کننده ی عفونت های دستگاه ادراری، که مسئول 6/1% عفونت های مجاری ادراری در ICU می باشد، به طور معمول این ارگانیسم همراه با عفونت های ایجاد شده در زمان استفاده از کاتتر مرتبط می باشد ( باستی و همکاران14 ، 2008 ).
2-6-4. پنومونی بیمارستانی:
در مطالعات انجام شده بر روی بیماران بستری در ICU مشخص شده که 5 تا 10% این افراد در اثر وجود باکتری اسینتوباکتر بومانی به پنومونی مبتلا شده اند و شکی نیست که پنومونی وابسته به ونتیلاتور(15VAP) در اثر اسینتوباکتر بومانی رخ می دهد(گاینس و ادوارد16 ، 2005 ).
2-7. عفونت های بیمارستانی:
عفونت های بیمارستانی به بروز یک بیماری جدید در فرد اطلاق می شود که در اثر بستری فرد در بیمارستان رخ می دهد که در بخش مراقبت های ویژه ICU بیشتر از سایر بخش ها مشکل ایجاد می کند ( یربن و همکاران 17، 2003 ).
مهم ترین راه انتقال عفونت از طریق دست های شسته نشده حاملین یعنی پرسنل بیمارستان می باشد. نقش عفونت های بیمارستانی در افزایش مورتالیتی، موربیدیتی و افزایش هزینه های بیمارستانی به خوبی روشن شده است و همچنین عفونت های بیمارستانی بعد از بیماری های قلبی عروقی، سرطان ها و عفونت ناشی از اجتماعات، چهارمین عامل معمول در مرگ و میر می باشد بنابراین درمان مناسب عفونت ها از اهمیت حیاتی برخوردار است. درمان مناسب شامل استفاده از دارو در یک دوره زمانی مناسب، شروع درمان ضد میکروبی در مراحل اولیه عفونت و استفاده از عوامل ضد میکروبی صحیح می باشد( نجاری و همکاران18،2003).
یکی از مهم ترین مشکلات در مورد عفونت های بیمارستانی ،انتشار قطعی مقاومت دارویی می باشد. مقاومت نسبت به عوامل ضد میکروبی در بین انواع زیادی از پاتوژن ها به خصوص پاتوژن های دخیل در عفونت های بیمارستانی، انتشار گسترده یافته است که به مشکل شدن درمان عفونت ها منجر می گردد و این امر سبب افزوده شدن میزان مرگ و میر در بیماران می شود به طوری که یک سوم از بیماران بزرگسال بد حال بستری در ICU به دلیل بیماری زمینه ای و کاهش ایمنی بدن آن ها بر اثر بیماری همراه عفونت، فوت می شوند.
یک راه طبقه بندی عفونت ها در ICU بر اساس معیار زمان می باشد و بروز عفونت پس از 48 ساعت از پذیرش در ICU ، عفونت بیمارستانی در نظر گرفته می شود. راه دیگر طبقه بندی بر اساس حالت حاملین می باشد که در این طبقه بندی، عفونت اندوژن اولیه هم توسط بیمار حمل شده است و عفونت اندوژن ثانویه توسط میکروارگانیسم هایی بروز می نماید که بعد از پذیرش در ICU کسب شده باشند که معمولا این ارگانیسمها به گروه باکتری های غیر معمول مثل باسیل های گرم منفی هوازی و استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین تعلق دارند.
باکتری های کومنسال مانند اشریشیاکلی و استافیلوکوک ها عمدتا باعث ایجاد عفونت های بیمارستانی می شود.طیف پاتوژنهای بیمارستانی در دهه گذشته تغییر یافته است به طوری که کوکسی گرم مثبت مثل استافیلوکوک ها و انتروکوک ها به تدریج مغلوب باکتری های گرم منفی شده اند و پاتوژن های قارچی، بخصوص در جمعیت بیماران ضعیف از نظر ایمنی اهمیت بیشتری را کسب کرده اند
( لیبراتی و همکاران19، 2004 ).
2-8. استراتژی های درمانی عفونت های اسینتوباکتر بومانی:
قبل از سال 1970،درمان عفونت های ایجاد شده توسط اسینتوباکتر به وسیله ی تعدادی ازآنتی بیوتیکها نظیر بتالاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها وتتراسایکلین ها امکان پذیر بوده ولی هم اکنون مقاومت به تمام آنتی بیوتیک های شناخته شده در اسینتوباکتر بومانی قابل مشاهده است و همین امر بیشتر متخصصان را در یک قلمرو نامشخص قرار داده و درمان های سودمند و رایج آنتی بیوتیکی را تحت مخاطره قرار داده است
( فالاگاس و بلیزیوتیس20، 2007 ).
2-9. داروهای ضد میکروبی رایج:
انتخاب آنتی بیوتیک ها برای درمان تجربی هنوز هم مورد بحث قرار دارد و باید بر پایه ی آخرین میزان حساسیت اعلام شده توسط موسسات تجویز گردد. با وجود تنوع ایجاد کننده عوامل مقاومت در اسینتوباکتر بومانی، درمان باید بر پایه ی انجام تست های حساسیت آنتی بیوتیکی مناسب انجام بگیرد. کارباپنم دارویی است که بر ضد طیف وسیعی از سویه های اسینتوباکتر بومانی که در سطح جهان گسترده است نیز فعال می باشد و برای درمان جدی عفونت های ایجاد شده توسط این باکتری مورد استفاده قرار می گیرد ( فالاگاس و بلیزیوتیس20 ، 2007 ).
2-9-1. پلی میکسین ها:
آنتی بیوتیک های پپتیدی نظیر پلی میکسین ها( کلی ستین، پلی میکسین E و پلی میکسینB) در نتیجه مقاومت سویه های اسینتوباکتر بومانی به تمام داروهای ضد میکروبی رایج شدند و در سال 1947 شناسایی و از باسیلوس پلی میکسا نشات گرفتند. این آنتی بیوتیک ها باعث جابجایی لیپیدها، آسیب دیدگی غشاء ناپایدار اسمزی می شوند به این صورت که مولکول های آنیونی لیپوپلی ساکارید(LPS21) غشاء خارجی باکتری گرم منفی را مورد حمله قرار داده و باعث ایجاد واکنش بین غشاء خارجی و غشاء داخلی سلول شده و منجر به مرگ سلولی می شوند (کلیوسل و همکاران22، 2007 ).
هم اکنون دو شکل تجارتی کلی ستین قابل دسترس است.کلی ستین متانوسولفات که برای مصارف تزریقی و دیگری کلی ستین سولفات که برای مصارف دهانی و موضعی می باشد . هر دو شکل می توانند به صورت تنفسی نیز مورد استفاده قرار یگیرند.
کلی ستین که به صورت تنفسی مصرف می شود به میزان زیادی باعث کاهش سمیت سیستماتیک و تقویت تاثیرگذاری دارو در جایگاه های عفونت می شود.
در تحقیقی که توسط سانگ انجام شد 86% افراد توسط سودوموناس آئروژینوزا و یا اسینتوباکتر بومانی، به پنومونی مبتلا شده بودند که این سویه ها به تمام آنتی بیوتیک ها به جزء پلی میکسین مقاوم بودند و کلی ستین تنفسی دریافت می کردند و پاسخ میکروبیولوژی مناسبی مشاهده شد .
2-9-2.آمینوگلیکوزیدها:
اسینتوباکتر بومانی دارای ژن هایی است که آنزیم های تغییر دهنده آمینوگلیکوزیدها را در اینتگرون کلاس 1 کد می کنند و باعث ایجاد مقاومت به چندین دارو می شود.
طی گزارشی که از ژاپن اعلام شده ، در اسینتوباکتر بومانی سویه (armA) متیلاسیون 16SrRNA دیده شده است که باعث جفت شدن نواحی اتصال آمینوگلیکوزیدها با جایگاه هدف خودش می شود در نتیجه مقاومت بسیار بالایی به تمام آمینوگلیکوزیدهایی که از نظر کلینیکی مفید هستند نظیر توبرامایسین، جنتامایسین، آمیکاسین ایجاد می کند . ژن armA توسط پلاسمید انتقال می یابد و داخل ترانسپوزون قرار گرفته است.پمپ AbeM جزئی از خانواده پمپ های MATE می باشد که آمینوگلیکوزیدها، سوبستراهایی برای این پمپ می باشند( مگنت و همکاران23 ، 2001 ).
2-9-3.سولباکتام:
سولباکتام ها در حقیقت یکی از سه مهارکننده ی بتالاکتاماز ها می باشند که این خاصیت آنها به علت اتصالشان به پروتئین متصل شونده به پنی سیلین می باشد( لوین24، 2002 ). تحقیقاتی که در زمینه ی مقایسه ی فعالیت سولباکتام به تنهایی با حالتی که در ترکیب با بتالاکتام ها می باشد انجام شده است، به وضوح نشان می دهد که فعالیت ذاتی سولباکتام ها بیشتر از توانایی آن ها برای مهار کردن بتالاکتامازها می باشد. حساسیت سویه های اسینتوباکتر بومانی به سولباکتام ها در شرایط آزمایشگاهی بسیار متفاوت است و وابسته به ناحیه ی جغرافیایی می باشد، بنابراین انجام تست های حساسیت با استفاده از روش مایع، بیش از روش دیسک دیفیوژن پیشنهاد می شود.
یوربن طی مطالعاتش در اسپانیا نشان داد که از 10 بیماری که آمپی سیلین-سولباکتام را به مدت بیشتر از 3 روز دریافت کرده بودند 9 تای آن ها از لحاظ کلینیکی پاسخ مثبت دادند و باکتری در آن ها ریشه کن شد ( یوربن و ماریانو ، 1993 ). نتیجه ای که از این مطالعه بدست آمد ، این بود که مصرف آنتی بیوتیک های حاوی سولباکتام در درمان عفونت های خفیف تر در حقیقت یک راهکار مناسبی برای محدود کردن مصرف گسترده کارباپنم ها می باشد و هم اکنون داده های قابل اطمینان تری در دسترس است که تاثیر مثبت سولباکتام ها را در درمان عفونت های شدید ایجاد شده توسط اسینتوباکتر بومانی نشان می دهد.
در مطالعات آزمایشگاهی صورت گرفته نشان داده شد که زمانی که سولباکتام با داروهایی نظیر سفی پیم، ایمی پنم، مروپنم، آمیکاسین، ریفامپین و تیکارسیلین-کلاولانات مورد استفاده قرار بگیرد فعالیتش افزایش می یابد( کوربلا و همکاران25، 1998 ).
2-9-4. کینولون ها:
ایجاد جهش هایی در ژن های gyrA و parC، باعث ایجاد تغییراتی در DNA gyrase و یا توپوایزومراز IV می شود، که این موتاسیون باعث دخالت در جایگاه های اتصال هدف می گردد. مشابه آمینوگلیکوزیدها، بسیاری از کینولون ها سوبسترای پمپ های انتشار به خارج چندین دارو، نظیر پمپ های AdeABC که از نوع پمپ های RND و پمپ های AdeM که متعلق به پمپهای خانواده MATE هستند، می باشند. هم چنین مقاومت های کینولونی که مرتبط با پلاسمید است مربوط به ژن qnr می باشد که تاکنون درمورد اسینتوباکتر بومانی گزارش نشده است( میلاتوویک و همکاران26، 2000 ).
2-9-5.تتراسایکلین ها و تایگلیسین ها:
مقاومت به تتراسایکلین ها و مشتقات آن ها مرتبط به پمپ ها و یا حفاظت ریبوزومی بود. وجود ژن های tet(A) تا tet(E)ارگانیسم های گرم منفی که مسئول کد کردن پمپ های اختصاصی انتشار به خارج تتراسایکلین هستند نیز یک دلیل مقاومت



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید