پایاننامه کارشناسی ارشد رشته زیستشناسی-میکروبیولوژی (M.Sc)
عنوان
بررسی مقایسهای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
و مایکوباکتریوم بوویس به روش SDS-PAGE
استاد راهنما
دکتر احمد رضا بهرمند
مشاور
دکتر مهناز سیفی
نگارنده
حانیه صرافی
سال تحصیلی 1392
چکیده
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل میباشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوشهای مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مايکوباکتريوم بوويس به عنوان عامل سل گاوي به صورت موردي انسان را نيز درگير مي کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتیژنهای باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شدهاند.
جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونههای ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونههای کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریومها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونیها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونیهای جدید، به منظور استخراج پروتئینهای ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.
با بررسی باندهای حاصله از پروتئینهای غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئینهای غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدودههای وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بودهاند.
در بررسی پروتئینهای ترشحی در سویههای مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدودهها مشاهده شد.
نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئینهای سویههای مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس میتواند مرجعی برای بررسیهای بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.
به نظر میرسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویههای حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب میتواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویههای حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.
فهرست مطالب
چکیده1فصل اول- مقدمه31-1. کلیات سل41-2. بیان مسئله51-3. اهمیت و ضرورت71-4. اهداف8فصل دوم- پیشینه تحقیق92-1. تاریخچه102-2. مايکوباکتريومها112-3. طبقهبندي مايکو باکتريومها122-3-1. فتو کروموژن132-3-2. اسکوتوکروموژن132-3-3. غیر کروموژن142-3-4. سریع الرشد142-4. باکتریولوژی سل142-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی152-6. خصوصیات رشد162-7 . فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس172-7-1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی182-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی182-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن182-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن192-8. فاکتورهای ویرولانس201-9. ديواره سلولي212-10. بیوشیمی دیواره سلولی232-11. بيماريزايي232-11-1. مکانیسم بیماریزایی252-12. درمان سل262-12-1. درمان سل حساس به دارو262-12-2. درمان سل مقاوم به دارو262-13. مقاومت دارويي مايكوباكتريوم توبركلوزيس272-14. مکانیسم مولکولی مقاومت دارویی282-14-1. مقاومت به ريفامپين282-14-2. مقاومت به ایزونیازید292-14-3. مقاومت به پيرازين آميد292-14-4. مقاومت به اتامبوتول302-14-5. مقاومت به استرپتومايسين302-14-6. فلورو کینولونها302-14-7. آمینوگلیکوزیدها312-14-8. سیکلوسرین312-14-9. پاراآمینوسالیسیلیک322-15. انواع سل332-15-1. سل ریوی332-15-2. سل خارج ریوی332-15-2-1. سل عقدههای لنفاوی332-15-2-2. سل پلور342-15-2-3. سل استخوانی342-15-2-4. سل سیستم عصبی مرکزی342-15-2-5. سل شکمی342-15-2-6. سل دستگاه تناسلی352-15-2-7. سل پریکاردیت352-15-2-8. سل ارزنی352-16. سل در کودکان362-17. سل و ایدز362-18. روشهای تشخیص سل372-18-1. تست پوستی372-18-2. کشت372-18-3. تهیه اسمیر382-18-4. تکنیک PCR382-18-5. بررسی اینترفرون گاما382-18-6. رادیوگرافی ریه392-19. اپيدميولوژي392-19-1. وضعیت بیماری سل انسانی در ایران412-20. مایکوباکتریوم بوویس442-20-1. اهميت سل گاوي 452-21. مایکوباکتریوم بوویس ب.ث.ژ452-21-1. فیلوژنی452-21-2. تاریخچه BCG482-21-3. تاریخچه تولید و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ایران502-21-4. ایمنیزایی512-21-5. لزوم طراحی واکسن جدید522-22. پروتئومیکس مایکوباکتریومها532-23. پیشینه تحقیق پروتئومیکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس58فصل سوم- مواد و روشها613-1. نمونهگیری 633-2. کشت و جداسازی باکتری 643-2-1. مواد مورد نیاز برای تولید محیط لوون اشتاین جانسون به میزان 5/1 لیتر643-2-2. طرز تهیه محیط کشت643-2-3. آلودگیزدایی و تغلیظ نمونهها653-2-3-1. آماده سازی محلولها663-2-4. روش کار کشت663-2-4-1. محیط کشت حاوی تیوفن 2- کربوکسیلیک اسید هیدرازید673-3. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریومها 673-3-1. تهیه گستره673-3-2. رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O683-3-3. رنگآمیزی ذیل- نلسون 693-3-4. رنگآمیزی کینون (رنگآمیزی سرد)703-3-5. بررسی و آزمایش گسترش 713-4. بررسی لولههای کشت 713-5. شناسایی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و بوویس723-5-1. تست نیاسین772-5-1-1. معرفها و مواد لازم تست نیاسین723-5-1-2. آمادهسازی محلولها ی نیاسین723-5-1-3. مراحل کارتست نیاسین733-5-2. آزمونهای احیای نیترات733-5-2-1. معرفها و مواد لازم تست نیترات733-5-2-2. آمادهسازی معرفهای تست نیترات 743-5-2-3. مراحل انجام کار تست نیترات743-5-2-4. استانداردهای احیاء نیترات743-5-3. تست کاتالاز753-5-3-1. محیط و مواد مورد نیاز763-5-3-2. آمادهسازی محلولهای تست کاتالاز763-5-3-3. مراحل انجام آزمایش روش نیمه کمی کاتالاز و کاتالاز 68 درجه763-5-3-4. نتایج و تفسیر آزمایش کاتالاز773-5-4. حساسیت به تیوفن 2- کربوکسیلیک هیدرازید (TCH)773-6. آزمایشات حساسیت داروئی در مایکوباکتریومها 773-6-1. تهیه محلول استاندارد مک فارلند783-6-2. تهیه سوسپانسیون باکتری 783-7. کشت سویههای انتخابی در محیط میدل بروک 7H9783-7-1. مواد مورد نیاز783-7-1-1. آمادهسازی محیط783-7-1-2. انتحاب سویهها و کشت803-8. جمعآوری سویهها میکروبی، استخراج و خالصسازی پروتئین803-8-1. استخراج پروتئینهای غشایی803-8-1-1. مواد مورد نیاز803-8-1-2. تهیه بافر و محلولها803-8-1-3. روش کار813-8-1-4. استخراج پروتئینهای ترشحی813-8-2. خالصسازی پروتئین813-8-2-1. مواد مورد نیاز813-8-2-1-1. آمادهسازی محلولها و مواد813-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئینهای غشایی833-8-2-1-3. ترسیب پروتئینهای ترشحی833-8-2-2. تعیین غلظت پروتئینها843-8-2-2-1. مواد مورد نیاز843-8-2-2-2. آمادهسازی محلول برادفورد853-8-2-2-3. روش کار853-9. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید(تک بعدی)853-9-1. مواد مورد نیاز863-9-2. آمادهسازی مواد863-9-3. روش کار883-9-3-1. رنگآمیزی کوماسی بلو R-250903-9-3-2. رنگآمیزی Blue Silver Staining903-10. تصویر برداری و آنالیز ژلها90فصل چهارم- نتایج914-1. جمعيت مورد مطالعه924-2. درصد سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جمعآوری شده از بیماران با توجه به موضع جداسازی934-3. مشاهده لام رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O934-4. مشاهده لام رنگآمیزی ذیل-نلسون944-5. نتایج کشتها944-6. آزمونهای بیوشیمیایی وحساسیت آنتیبیوتیکی954-7. نتایج تعیین غلظت پروتئینها974-8. نتایج مربوط به تفکیک پروتئینها بر اساس وزن مولکولی98فصل پنجم- بحث و نتیجه گیری 102پیشنهاد 108منابع 109چکیده انگلیسی 117
فهرست نمودارها
2-1: ميزان بروز بيماري سل در طول 46 سال گذشته در ایران414-1: نتایج کشت مثبت924-2: منحنی استاندارد98
فهرست جداول
2-1: تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس152-2: داروهاي خط دوم درمان توبركلوزيس322-3: تخمین موارد ومتوسط میزان بروز سل در جهان در سال2010402-4: به تفکیک دانشگاههای علوم پزشکی کشور422-5: برخی تغییرات ژنی در سویههای BCG M. bovis473-1: نحوه گزارش میکروسکوپی713-2: مواد تشکیلدهنده بافرتخلیص813-3: مواد تشکیلدهنده محلول PBS x10833-4: مواد تشکیلدهنده محلول برادفورد853-5: مواد تشکیلدهنده Running Buffer 10%863-6: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel stain873-7: مواد تشکیلدهنده Coomassie Gel Destain873-8: مواد تشکیلدهنده Fixation solution873-9: مواد تشکیلدهنده Stainining solution883-10: مواد تشکیلدهنده ژل 10%,12.5% Separating893-11: مواد تشکیلدهنده ژل Stacking 5%894-1: درصد نمونههای بالینی934-2: نتایج تستهای بیوشیمیایی964-3: نتایج تستهای حساسیت آنتیبیوتیکی و TCH97
فهرست تصاویر
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، بهدلیل بیماری سـل 112-2: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس162-3: کلنیهای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون172-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس222-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 2012402-6: درخت تبارشناسی زیرسویههای مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آنها و خصوصیات مولکولی462-7: برخی از عکسهای تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ493-1: مرحله دیالیز843-2: آمادهسازی صفحات شیشهای884-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین934-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون944-3: فاکتور طنابی (cord factor)954-4: تفسیر تست نیترات954-5: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250994-6: باندهای پروتئینهای غشایی سویههای M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% رنگ آمیزی Blue Silver Staining1004-7: باندهای پروتئینهای ترشحی سویههای M. bovis و M. TB 1015-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس 106

فصل اول
مقدمه
1-1. کلیات سل
سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسانهای عصر حجر و استخوانهای مومیایی شده مصریان باستان جدا کردهاند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه يكي از بزرگترين مسائل بهداشتي جهان، بيماري سل است. حدس زده ميشود كه از هر سه نفر جمعيت جهان، يك نفر به باسيل سل آلوده بوده و درهر ثانيه يك نفر به تعداد آنان افزوده ميشود. نگران كننده اين است كه طبق برآوردهاي موجود 50 ميليون نفر از اين افراد، به باسيل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 ميليون نفر درجهان به بيماري سل مبتلا هستند كه بيش از 80% اين موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.
در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 ميليون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 ميليون نفر در اثر اين بيماري جان ميسپارند. بيش از 90% موارد بيماري و مرگ ناشي از سل در كشورهاي در حال توسعه رخ ميدهد، كشورهايي كه 75% موارد بيماري در آنها به فعالترين گروه سني به لحاظ اقتصادي (يعني 15 تا 54 سالگي) تعلق دارد.
آلودگي همزمان به ويروس ايدز خطر ابتلا به بيماري سل را به طور معنا داري افزايش ميدهد. كشورهاي با شيوع بالاي HIV، به ویژه كشورهاي واقع در افريقاي زير صحرا، شاهد افزايش چشمگير تعداد بيماران مبتلا به سل و افزايش 2 تا 3 برابر ميزانهاي بروز گزارش شده سل در دهه 90 بودهاند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).
سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی1 وخلط سینه بیماران2 میباشد. اما روشهای سرایت دیگری همچون تلقیح مستقیم باسیل سل در پوست مجروح کسانی که با بافت آلوده سروکار دارند نیز توصیف شده است. ورود باسیل سل به بدن یک فرد ضرورتا ایجاد بیماری سل نمیکند، اولین فاکتورهای افزایش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصیات شخصی هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسیت ژنتیکی)، عوامل اجتماعی (مانند فقر غذایی و شرایط زیستی) و عواملی نظیر سرکوب سیستم ایمنی3 ناشی از داروهای استروئیدی یا بیماریهایی نظیر سرطان خون، بیماریهای دستگاه رتیکولواندوتلیال، دیابت شیرین4، بیماریهای قارچی سیستمیک و ایدز5 میباشد (Jonas V. et al., 1993).
کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس (MTB) 6که شامل مايکوباکتريوم توبرکلوزيس7، افريکانوم8، بوويس9، بوويس10BCG، کاپرهاي11، ميکروتي(mycobacterium microti)، پنيپدي، dassie bacillusو کانتي (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصيات فنوتيپي متفاوتي در تستهاي بيوشيميايي از خود نشان ميدهند اما همولوژي بالايي به لحاظ ژنتيکي دارند .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس براي پيشبرد درمان موفق ضروري است بالاخص در مناطقي که بيماري به صورت اپيدميک در ميآيد يا تماس انسان و حيوان زياد است .(Barouni A.S. et al., 2004)
همانطور که ذکر شد M. bovis یکی از قدیمیترین و مهمترین عامل بیماری سل بین انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب میشود. ميزان مرگ و مير ناشي از M. bovis بيشتر از M. tuberculosis ميباشد .(Majoor C.J. et al., 2011) تشخيص M. bovis و M. bovis BCG از ديگر اعضاي کمپلکس MTB بدليل مقاومت ذاتي (Scorpio A. et al., 1997) آنها به آنتي بيوتيک پيرازيناميد12 از اهميت راهبردي برخوردار است .(Jure´en P. et al., 2008)اين در حالي است که مقاومت به پيرازيناميد در مايکوباکتريومهاي غير کمپلکس MTB عموميت ندارد .(Sun Z. et al., 1997) پيرازيناميد جزو داروهاي خط اول مقابله با بيماري سل و قادر به از بین بردن باکتريهاي غیر فعال و احتمالا داخل سلولي است. اين خصوصيات امکان کاهش زمان درمان از ۱۲-۱۸ ماه به ۶ ماه را امکانپذير ميکند (Lee K.W. et al., 2001).
روشهاي کلاسيک افتراقM. tuberculosis و M. bovis و تستهاي حساسيت به دارو بر پايهي احياي نيترات13، فعاليت آنزيم پيرازيناميداز (Pyrazinamide)، تجمع نياسين و رشد در محيط تيوفن ۲-کربوکسيليک اسيد هيدرازيد14 استوار است .(Monteros L. et al., 1998)
1-2. بیان مسئله
در حال حاضر سل بیش از سایر بیماریهای عفونی دیگر مانند مالاریا (Malaria)، ایدز و بیماریهای گرمسیری Tropical diseases)) در بین جمعیت بالای 5 سال تلفات دارد. طبق برآوردها در سال 2011، 7/8 میلیون مورد جدید سل (13% ابتلا مشترک با HIV ) دیده شد که 4/1 میلیون نفر در اثر ابتلا جان خود را از دست داده که از این تعداد سهم ابتلا مشترک با HIV 430000 نفر بوده است .(who., 2011) یک فاکتور مهم برای پیشرفت به توبرکلوزیس فعال در افراد با عفونت نهفته توبرکلوزیس میشود. عامل مرگ و میر در جهان در مقایسه با سرخک15 (با 2میلیون مرگ در جهان) و مالاریا (با یک میلیون مرگ در جهان) محسوب میگردد. بنابر گزارش سازمان بهداشت جهانی (W.H.O) و مرکز کنترل بیماریها در آمریکا (CDC) سل مسئول حدود 27% از موارد مرگ ومیر در سراسر جهان میباشد.
باتوجه به اینکه تنها راه محافظت از افراد سالم جامعه در برابر سل، ایمنیسازی، تشخیص سریع و درمان به موقع و کامل بیماران خواهد بود و نکته قابل توجه اینکه پیدایش سویههای M. tuberculosis مقاوم به آنتیبیوتیک16 و عدم کارایی واکسن BCG در بزرگسالان، تلاش برای دستیابی و گسترش ابزارهای تشخیص، پیشگیری و درمان سل یک ضرورت جهانی شده است .(Barker L.F. et al., 2009)
BCG تنها واکسن در دسترسی علیه توبرکلوزیس است که شامل یک خانواده هتروژنوس از یک زیر سویه با ژنوتیپ و فنوتیپ مشخص است. سازمان جهانی بهداشت عنوان کرده است که تشخیص زیرسویههای BCG در هر دو سطح ژنومیک (Genomic) و پروتئومیک (Proteomics) برای دستیابی به پاسخ ایمنی مناسبتر، لازم است .(Berredo-Pinho M. et al., 2011)
واكسنBCG نميتواند از عفونت M. tuberculosis جلوگيري كند ولي از فرمهایهاي شديد بيماري ممانعت ميكند. همچنين در افراد آلوده به M. tuberculosis، واكسيناسيونهاي بعدي با واكسن BCG باعث بالارفتن قدرت سيستم ايمني نميشود.
بیشتر آنتیژنهای مورد استفاده در واکسنهای نوترکیبBCG در پروتئینهایی به شدت غیر قطبی وجود دارند که خود این امر مسائلی را برای تولید این پروتئینها به منظور مصارف واکسن به همراه دارد .(Macedo G.C. et al., 2011)
در سال 1998،cole و همکاران، به تعیین توالی کامل ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوریسH37RV پرداختند و توانستد 3924 ژن منفرد را تعیین توالی کنند و به کمک این اطلاعات ژنتیکی مکمل، آنالیز پروتئوم به کمک ترکیبی از روشهای الکتروفورز دو بعدی و mass specterometry صورت گرفت (Britton W.J. et al., 1987). حدوداً 800 پروتئين ترشحي كد شونده توسط ژنوم M. tuberaulosis شناخته شده است.
در سال 1999،jungblut و همکاران از طریق مقایسه ژنتیکی به بررسی پروتئوم دو سویه غیر ویرولانس مایکوباکتریوم بوویس BCG(Chicago and Copenhagen) با دو سویه وحشی، M. tuberculosis (H37RV and Erdman) پرداختند تا از این طریق پروتئینهای مناسب برای توسعه دادن واکسن جدید تشخیص داده شود و در درمانهای جدید به کار رود. این سویهها به وسیلهSDS- page و الکتروفورز دوبعدی آنالیز شدند. ویژگیهای پروتئینها به وسیله طیفسنجی جرمی شناسایی و به وسیله پایگاه دادهای از الکتروفورز دو بعدی معرفی شد که 263 پروتئین مایع رویی کشت مایکوباکتریومی شناسایی شد. از این تعداد 54 مورد متعلق به سوپرناتانت کشت بوده، 16 پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین مایکوباکتریوم توبرکلوزیسH37RV وErdman و 25 پروتئین متفاوت از نظر شدت و موقعیت بین M. tuberculosis H37RV و M. bovis BCG شناسایی شد (Jungblut P.R. et al., 1999).
در سال 2003، Jens Mattow و همکاران، آنالیز فراگیر پروتئینهای سوپرناتانت کشتM. tuberculosis H37RV به کمک ترکیب روشهای الکتروفورز 2 بعدی، mass spectrometry و تعیین توالیN-terminal پرداختند. آنالیز ژل الکتروفورز دو بعدی حدود 1250 قطعه پروتئین را ازM. tuberculosis H37RV شناسایی شد. این مطالعه 137 پروتئین مختلف را نشان داد که 42 تا از آنها قبلاً به عنوان پروتئین ترشحی توضیح داده شده و از مقایسه پروتئوم ازM. tuberculosis H37RV و M. Bovis BCG Copenhagen ضعیف شده 39 تکه پروتئین مخصوصM. tuberculosis را نشان داد که دارای 27 پروتئین مختلف بودند که می تواند به عنوان کاندیدی از آنتیژنها برای تهیه واکسنی جدید باشد (Mattow J. et al. 2003). در بین پروتئینهای مشخص شده در پروتئوم مایکوباکتریومها، تعدادی هستند که بعنوان آنتیژنهای مایکوباکتریایی ارزش بالقوهای در تولید واکسن دارند و همچنین ارزش تشخیصی هم دارند. این پروتئینها شامل آلانیندهیدروژناز17Hsp6018(RV0440) (RV2780)،Hsp70 (RV0350) ، اعضا کمپلکس آنتیژن85 کیلودالتونی، αکریستالین و آنتیژن35 کیلودالتونی از مهمترین موارد هستند. پروتئین34 کیلودالتونی بنام آنتیژن 84 در مایکوباکتریوم کانزاسی19 و بوویس BCG، مایکوباکتریوم لپره20 و M. tuberculosis وجود دارد .(Komiya K. et al., 2011 ; Farshadzadeh Z. et al., 2010)
1-3. اهمیت و ضرورت
چالشهاي زيادي در برابر توليد واكسن موثر برعليه سل وجود دارد. با مطالعات انجام شده تخمين زده ميشود که 3/1 جمعيت دنيا با M. tuberculosis آلودهاند. هر واكسن جديد بر عليه بيماري توبركلوزيس بايد جهت استفاده در جمعيت مناسب باشد. همچنين در افرادي كه خطر فعال شدن بيماري در آنها بسيار زيادتر است (مثل افراد آلوده به HIV كه با M. tuberculosis نيز آلودهاند)، واكسن جديد بايد بتواند به عنوان يك داروي محرك ايمني21 به همراه داروي پروفيلاكسي در پاكسازي بدن از باكتري موثر باشد.
مطلب قابل توجه دیگر اینکه افراد زیادی با BCG واكسینه شده اند، لذا هر واكسن موثر جديد بايد بتواند اين جمعيت بزرگ را كه با BCG واكسينه شدهاند را نيز در برابر عفونت توبركلوزيس محافظت كند (Martin C., 2005). همچنین تشخیص و درمان بموقع بیماری نیز از اهمیت خاصی برخوردار است.
تمامی چالشها محققان زيادي را در مراكز تحقيقاتي دنيا مشغول مطالعه استراتژيهاي جديد واكسيناسيون بر عليه توبركلوزيس کرده است تا بتوانند واكسني موثرتر از واكسن حال حاضر يعني BCG معرفي نمايند.
یکی از راه کارهای مناسب، بررسی پروفایل پروتئینی سویههای M. tuberculosis و M. bovis است، که مطالعهی پایلوت را به منظور تفاوت در الگوی پروتئینها بیان میکند.
آنالیز پروتئینی باکتریها بسته به روش جداسازی آنها اهمیت خاصی دارد. ترکیب خاص از روشهای مختلف از جمله SDS-page22 و الکتروفورز دوبعدی23 میتواند منجر به ارائه اطلاعات مفیدی درخصوص پروتئینهای اختصاصی باکتریها شود.
1-4. اهداف
پس از بررسی تفاوت در الگوی پروتئینها با روش SDS-page، در ادامه میتوان با تکنیکهای مناسب پروتئینهای اختصاصی باکتریها را معرفی نمود و با مقایسه آنها به روشهای نوین تشخیصی، درمانی و پیشگیری رسید .(Mollenkopf HJ. et al., 2004) اگر چه تا به حال اطلاعات كامل ژنوميك و پروتئوميك در مورد M. tuberculosis بدست آمده است ولي متاسفانه هنوز كانديدهاي مناسب واكسن شناخته نشدهاند. هيچ كدام از واكسنهاي پروتئيني و DNA نیز نتوانستهاند تاكنون مصونيت بخشي بهتر از واكسن BCG را القاء نمايند اما در موش توانستهاند مصونيتهاي نسبي بر عليه عفونت M. tuberculosis راتوليد نمايند. فرمولاسيون هاي جديد آنتيژن مثل استفاده از آنتيژنهاي متعدد يا اپيتوپهاي متعدد، در حال تحقيق و بررسياند .( Martin C., 2005)
فصل دوم
پیشینه تحقیق
2-1. تاريخچه
بيماري سل از دير باز در جوامع انساني شايع بوده و در اسكلت انسانهاي عصر حجر و نيز در استخوان هاي موميايي شده در مصر فرم غیرریوی (سل مهرهای) يافت گرديدهاست (تصویر2-1). بقراط پزشک یونانی در 460 سال قبل از میلاد مطالبی در مورد این بیماری و علائم آن نوشته است. جالینوس (130 سال قبل از میلاد) بیماری سل را مداوا مینمود و به جدا کردن بیماران از دیگران اعتقاد داشت (Dufault P., 1941). محمد ذکریای رازی (953-850 میلادی) و ابوعلی سینا (1037-980 میلادی) علائم بیماری را در بیماران خود توصیف نمودهاند (Grigy E., 1958).
با این وجود نخستين بار ماهيت بيماري سل، به وسيله ويلمين در سال 1865 شناخته شد. او ثابت كرد كه اين بيماري، مسري بوده و اگر از ضايعات سل انسان به كبك يا خرگوش تزريق گردد، در حيوانات ايجاد بيماري مي‌شود اين بيماري كه اولين بار فساد بافت ناميده شد، بعنوان بيماري مسري در بين اقوام مديترانه در قرن 16 شناخته گردید (Segundo. et al., 2000).
در قرن 19 بيماري سل به عنوان طاعون سفيد24 شناخته شد که مسبب مرگ و میر بسياري در اروپا و امريكا بود. چنانچه تخمين ميزان مرگ و مير ناشي از اين بيماري در سال 1830 بسيار بالا بوده است (از هر 000/100 نفر 400 نفر). در سال 1882، اين باكتري بوسيله رابرت كخ25 كشف گرديد و به همين جهت، آن را باسيل كخ نيز ‌ناميدهاند. كخ توانست باكتري را از خلط و ضايعات بيمار به دست آورد و براي اولين بار، اين باكتري را بر روي محيط سرم منعقد شده گاو و گوسفند كشت داد. علاوه بر اين، با تلقيح به حيوان حساس، در حيوان ايجاد بيماري نمود و از حيوان، باكتري اوليه را بدست آورد. این روند امروزه بنام اصول كخ معروف است. با شروع قرن 19، پزشكان دو ابزار مهم جهت تشخيص سل در دست داشتند:
1 – تشخيص عامل بيماريزايي به وسيله ميكروسكوپ (رابرت كخ در 1905)
2- اشعه X از سينه (ويليام كونارد در 1901).
امروزه هم اين دو روش همچنان ابزارهاي پايه تشخيص سل ميباشند (Boer As. et al., 1999). از جمله تحقیقات مهم در زمینه سل، کشف ساختار مقاوم به اسید و الکل با کمک رنگآمیزی با روش ذیل نلسون در این باکتری می‌باشد. اساس این رنگ‌آمیزی با مشارکت ارلیش، ذیل و نلسون26 شکل گرفت. تشخیص افتراقی باسیل سل مرغی در انسان به ترتیب در سال 1889 توسط ریولتا27 و 1890 توسط مافوکی28 انجام گردید. توبرکولین در سال 1891 توسط کخ تهیه شد و بعدها در سال 1902 باسیل سل گاوی توسط اسمیت شرح داده شد (Kalkut G., 2000).
اولين آنتيبيوتيكهايي كه جهت درمان بيماري سل به كار گرفته شدند، استرپتومايسين (Streptomycin) و پاراآمينوساليسيك اسيد (para aminosalicylic acid) بوده كه در دهه 1940 تجويز شدند. اين داروها به طور موفقيت آميزي به صورت مجزا تجويز ميشدند ولي بعد از مدت کوتاهي، مقاومت نسبت به اين دو دارو ديده شد. در اواخر دهه 1950، ايزونيازيد (isoniazid) را به رژيم درمان سل اضافه كردند. در ابتدا اتامبوتول و سپس در اول دهه 1970، ريفامپين معرفي شدند. پس از سه دهه، داروهايي به رژيم دارويي سل اضافه شد كه در فاز I و II موارد باليني مورد استفاده قرار ميگيرند (Yam WC., 2006).
داروهاي انتخابی خط دوم در درمان سل شامل فلوروکينولونها، آميكاسين‌، كانامايسين، كاپرئومايسين، اتيوناميد، پاراآمينوسياليسيك اسيد، سيكلوسرين، تياكتازون ميباشند. تمامي داروهاي خط دوم درمان، گران قيمت بوده و كارايي و ويژگي پاييني داشته و سميت بالايي دارند (Limeschenko E. et al., 2008).
تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر،استخوان سـتون فقرات دارای بدشـکلی Pott،
کـه بهدلیل بیماری سـل ایـجاد میشود.
2-2. مايکوباکتريومها
مايکوباکتريومها، ارگانيسمهاي ميلهاي شکل، نازک و بدون تحرک متعلق به خانواده مايکوباکترياسه و رده اکتينوميستالها و کلاس اکتينومايسه ميباشند ( .(Rastogi N. et al., 200lدر حال حاضر تا ژانویه سال 2010 تعداد 158 گونه مختلف در جنس مايکوباکتريوم شناسايي شده است (Limeschenko E. et al., 2008). اين گونه ها طيف وسيعي از عفونتهای موضعي تا بيماريهای منتشر را در انسان و حيوانات ايجاد مي کنند. اگرچه بعضي از گونهها فقط در انسان عفونت ايجاد ميکنند، ساير گونهها از حيوانات گوناگوني جدا شدهاند. همچنين گونههاي زيادي در آب و خاک يافت شدهاند. از بسياري جهات، مايکوباکتريومها را بر اساس تفاوتهاي بنيادي در اپيدميولوژي و بيماري، به دو گروه اصلي:
1-کمپلکسمايکوباکتريومتوبرکلوزيس (مايکوباکتريوم توبرکلوزيس، مايکوباکتريوم آفريکانوم، مايکوباکتريوم بويس، مايکوباکتريوم ميکروتي و مايکوباکتريوم کانتي) که کند رشد و کلني آنها فاقد پيگمان ميباشند .
2- مايکوباکتريومهاي غير توبرکلوزيس NTM29) یاMOTT30 ) تقسيم ميکنند (Collins C.H. et al., 1997).
2-3. طبقهبندي مايکوباکتريومها
با ظهور تکنولوژي تعيين توالي اسيدهاي نوکلئيک و ژنوتايپينگ اين امکان به وجود آمده است که ارتباط بهتري در توصيف مجدد ژنوتايپينگ و فنوتايپينگ موجود، فراهم شود. چنانچه اين موضوع در تشخيص گونههاي جديد هم موثر بودهاست. نامگذاري باکتريها به وسيله کد بين المللي صورت گرفته و نام صحيح مربوط به طبقه باکتري بر اساس درج باکتري در منابع معتبر علمي که داراي نشر طولاني و اعتبار قانوني در مجامع علمي هستند صورت ميگيرد. از اوايل ژانويه 1980 نام باکتريهاي قبلي بر اساس ليست تائيد شده نامگذاري باکتري31 انجام گرفت و هر باکتري که نام آن در ليست موجود نبود در نامگذاري قرار نميگرفت. براساس علائم کلينيکي مهم، مايکوباکتريوم‌ها به 3 گروه اصلي طبقه‌بندي مي‌شوند:
1- شديداً پاتوژن، از جمله پاتوژن‌هاي انساني شامل مايکوباکتريوم توبرکلوزيس و مايکوباکتريوم لپره و پاتوژن‌هاي حيواني شامل مايکوباکتريوم بوويس.
2- پاتوژنهاي فرصتطلب (يا پاتوژنهاي بالقوه) شامل مايکوباکتريوم سيميه32، مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم گزنوپي33.
3- ندرتاً پاتوژن شامل ساپروفيتهايي مانند مايکوباکتريوم فله‌اي34 و مايکوباکتريوم اسمگماتيس35.
در ميان پاتوژن‌هاي بالقوه عبارت کمپلکس مايکوباکتريوم آويوم، مايکوباکتريوم اينتراسلولار-مايکوباکتريوم اسکوروفولاسئوم36 (MAIS) قبلا به گروهي از مايکوباکتريوم‌هاي کند رشد اطلاق مي‌شد که از نظر خصوصيات ظاهري به هم شبيه و در برخي مواقع تفريق آنها از يکديگر مشکل بود (Collins C.H. et al., 1997). امروزه واژه MAIS کاربرد چنداني ندارد بطوريکه با استفاده از تکنيک‌هائي مانند: هيبريديداسيون اسيد هسته‌اي DNA-hybridisition))، آناليز آنتيژني و توانايي ارگانيسم در هيدروليز اوره، مايکوباکتريوم اسکوروفولاسئوم به راحتي از مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم اينتراسلولار قابل تقکيک است. واژه ديگري که بسيار کاربرد دارد کمپلکس مايکوباکتريوم آويوم (MAC) است که دربر گيرنده دو گونه مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم اينتراسلولار مي‌باشد که قبلا تحت گونه مجزا به نامهاي مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه آويوم، مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه پاراتوبرکلوزيس و مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه سيلواتيکم تشکيل مي‌گرديد. در بين گروه مايکوباکتريوم آويوم، مايکوباکتريوم پاراتوبرکلوزيس به جهت نياز به مايکوباکيتين در محيط کشت از بقيه به راحتي قابل تفريق است (ميانگين تقسيم آن 48 ساعت ومدت زمان رشد حدود 16 هفته است) (Bull T.J and Shanson D.C., 1992).
معمولاً و نه الزاماً مايکوباکتريوم‌هاي فرصت طلب، پاتوژن‌هائي کند رشد با ميانگين تقسيم 42-12 ساعت بوده و ميانگين لازم براي رشد آنها در محيط کشت اختصاصي حدود 15 تا 28 روز است. البته اين در مورد مايکوباکتريوم لپره استثنا مي‌باشد که توانائي رشد بر روي محيط مصنوعي را نداشته و تکثير آن در حيوانات آزمايشگاهي بين 7 تا 14 روز بطول ميانجامد. در مقابل بسياري از پاتوژنهاي نادر يا گونه‌هاي ديگر مايکوباکتريوم‌هاي ساپروفيت هم وجود دارند که داراي رشد سريعي بوده و متوسط تقسيم آن‌ها بين 2 تا 6 ساعت متغير است و زمان لازم براي رشد روي محيط کشت، در مورد باکتري‌هاي اخير 1 تا 7 روز است (Salfinger M and Pfyffer G.E., 1994).
رانیون (Runyon) مایکوباکتریهای آتیپیک را بر اساس خصوصیات فنوتیپی مثل داشتن رنگدانه و سرعت رشد به چهار گروه تقسیم‌بندی نمود. گروههای یک، دو و سه تنها شامل مایکوباکتریهای کند رشد بودند، مثل ارگانیسمهایی که به بیش از یک هفته زمان برای رشد نیاز دارند، در حالیکه گروه چهار شامل گونه‌های سریع رشد بوده که به یک هفته یا کمتر زمان برای رشد نیاز دارند.
2-3-1. فتو کروموژن37
گروه یک رانیون شامل گونه‌های میباشد که کلنیهایشان تنها در حضور نور قابلیت ایجاد رنگدانه را دارند (گونه‌های مهم آن از نقطه نظر پزشکی شامل مایکوباکتریوم کانزاسی و مایکوباکتریوم مارینوم می‌باشد).
2-3-2. اسکوتوکروموژن38
گروه دوم شامل گونه‌های اسکوتوکروموژن بوده (کلنیهای آنها در حضور و یا در غیاب نور تولید رنگدانه مینماید) که می‌توان از مایکوباکتریوم گوردونه و مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم نام برد.
2-3-3. غیر کروموژن39
گروه سوم شامل گونههای غیر کروموژن میباشند (کلنیهای بدون رنگ ایجاد میکنند) شامل مايکوباکتريوم آويوم، مایکوباکتریوم اینتراسلولار و مایکوباکتریوم گزنوپی میباشند.
2-3-4. سریع الرشد40
گروه چهارم رانیون شامل مایکوباکتریومهای سریع الرشد (گونههای مهم از نظر پزشکی شامل مایکوباکتریوم فورتوئیتوم و مایکوباکتریوم شلونئی است) (David H.L. et al., 1987).
2-4. باکتریولوژی سل
گونههای پاتوژنیک به کمپلکس مایکوباکترویوم توبرکلوزیس تعلق دارند. مایکوباکتریومها، باسیلهای غیرمتحرک و بدون اسپور هستند. محتوی گوانین و سیتوزین (G+C) در این باکتریها نزدیک به 61-71% میباشد. محتوی لیپیدی این باکتریها احتمالا بیشتر از تمام باکتریها میباشد. مایکوباکتریوم و سایر جنسهای نزدیک (کورینه باکتریها، گوردونا، تسوکامورلا، نوکاردیا، رودوکوکوس و دایتزیا Dietzia)) دارای ساختار و ترکیبات دیواره سلولی مشابهای هستند Barrera L., 2007)).
اعضای کمپلکس توبرکلوزیس، عوامل مختلفی هستند که توانایی ایجاد سل در انسان را دارند. این عوامل از لحاظ میزبان، مخزن و قابلیت انتقال از حیوانات، از هم تفکیک میشوند. M. tuberculosis و واریانتها یا زیر تیپهای منطقهای مایکوباکتریوم افریکانوم (Mycobacterium africanum) و مایکوباکتریوم کانتی (Mycobacterium canetti) پاتوژن های اولیه در انسان هستند. مایکوباکتریوم بوویس (Mycobacterium bovis) و مایکوباکتریوم میکروتی (Mycobacterium microti) عامل بیماری سل در حیوانات هستند که میتوانند به انسان منتقل شوند. بعضی از سویه های خاص جدا شده از بزها و خوک های آبی به نام مایکوباکتریوم کاپره (Mycobacterium caprae) و مایکوباکتریوم پینیپدی (Mycobacterium pinnipedi) که گاهی به عنوان زیرگونه یا واریانتهایM. bovis نامگذاری میشوند، نیز می توانند باعث ایجاد بیماری در انسان شوند. شاید محیط های مختلف این گونهها باعث تفاوتهای مهم میکروبیولوژیکی اعضای این کمپلکس شده است. گونههای اشاره شده به همراه سویههای واکسن BCG اعضای کمپلکس را تشکیل میدهند (جدول 2-1). شباهت بالای ژنومی اعضای کمپلکس نیز از نکات قابل ذکر میباشد. البته روشهای مولکولی برای تفریق گونههای کمپلکس مایکوباکتریوم ابداع شده است Barrera L., 2007)).
توبرکلوزیس هنوز به عنوان یک معضل بهداشتی در دنیا مطرح می باشد و تقریبا یک سوم از مردم دنیا به این باکتری آلوده میباشد. تخمین زده میشود که بین سالهای 2000 تا 2020 نزدیک به 1 بیلیون به میکرب سل آلوده خواهند شد و 200 میلیون از این جمعیت دچار بیماری شده و 35 میلیون نفر در اثر این بیماری خواهند مرد (Boer As. et al.,1999). تشخیص اولیه به همراه درمان کافی و تدابیر پیشگیری برای کنترل انتقال بیشتر بیماری سل مورد نیاز میباشد. بعلاوه به دلیل میزان بالای اخیر شیوع عفونتهای ناشی از مایکوباکتریومهای آتیپیک به ویژه در مبتلایان به ایدز و افراد دچار نقص ایمنی، تشخیص درست وصحیح گونه مایکوباکتریایی برای اتخاذ تدابیر درمانی درست، ضروری میباشد . (Neonakis I.K. et al., 2008)
جدول 2-1: تاکسونومی اعضای کمپلکس توبرکلوزیس
2-5. مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی
باسيل سل انساني به صورت ميلهاي باريک، کمي خميده به طول 2 تا 4 ميکرون و قطر 2/0 تا 5/0 ميکرون است که قطر آن در تمام طول ممکن است يکسان باشد. ولي اغلب به صورت دانهدار با واکوئولهاي بيرنگ و دانههايي که به شدت رنگ پذيراند و به فواصل نامنظم از يکديگر قرار دارند ديده ميشود. در محيط کشت، اشکال کوکوئيد تا رشتهاي ممکن است ديده شود (Harrison T.R., 2003) )تصویر 2-2).
تصویر2-2: عکس برداری توسط میکروسکوپ الکترونی ازM. tuberculosis
مطالعه با ميکروسکوپ الکتروني نشان ميدهد که مايکوباکتريومها پروکاريوت هستند و مواد هسته، از جمله DNA، به وسيله غشا از سيتوپلاسم جدا نيستند. شکل آنها به وسيله يک ديواره ضخيم و محکم شامل دو لايه حاجب- الکترون که به وسيله لايه کم تراکم ديگري از يکديگر جدا شدهاند حفظ ميشود و حذف ديواره سلولي به کمک مواد شيميايي، شکل ميلهاي آنها را به صورت ساختمان کروي يا اسفروپلاست تغيير ميدهد (. (Kohn., 1986
هسته مايکوباکتريومها شامل رشتههايي است که احتمالا يک مولکول DNA مارپيچي دراز به طول 30 آنگستروم ميباشند. به نظر ميرسد که مايکوباکتريها، ارگانيسمهاي يک هستهاي هستند. بررسيهاي بيوشيمايي نشان ميدهد که DNA مايکوباکتريومها يک مولکول دو رشتهاي حاوي مقادير زياد گوانين و سيتوزين است و وزن مولکولي آن در حدود 109× 6/4-5/2 دالتون برآورد شده است (Segundo A., et al., 2000 (Kohn., 1986 ; .
2-6. خصوصیات رشد
بر خلاف ساير باکتريهاي بيماريزا که بيهوازي يا هوازي اختياري هستند، باسيل سل هوازي اجباري است و ميتواند در محيطهاي کشت مصنوعي ساده حاوي گليسرين به عنوان منبع کربن و املاح آمونيوم به عنوان منبع ازت رشد کند. آسپاراژين يا مخلوطي از اسيدهاي آمينه معمولا به محيط کشت افزوده ميگردند تا شروع رشد را تسهيل و سرعت آن را بهبود بخشند. اگرچه مايکوباکتريومها به اثر مهار کننده مواد چربي در محيط کشت خيلي حساسند ولي مقادير اندک اسيدهاي چرب با زنجير طويل موجب تحريک آنها ميشوند.PH مناسب رشد مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حدود 6 تا 8 و pH متوسط 8/ 6- 5/6 است اختصاصات رشد بر حسب سويه باسيل، محيط رشد و غيره متفاوت است. رشد باسيل سل در محيطهاي کشت جامد، مثل محيط تخم مرغ، انبوه و فراوان است و پرگنهها برجسته، زبر با ظاهري گل کلمي يا مخروطي نا منظم، خشک و شکننده ميباشد (تصویر2-3). سرعت رشد باسيل سل چه در محيط کشت و چه در بدن حيوانات کند است ولي بعضي از مايکوباکتريومهاي ساپروفيت رشد سريعتري دارند و به طور کلي سرعت رشد مايکوباکتريومها خيلي آهسته تر از ساير باکتريها است (Segundo A. et al., 2000 ; Kohn., 1986).
تصویر2-3: کلنیهایM. tuberculosis روی محیط لونشتاین جانسون
2-7. فیزیولوژی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
مایکوباکتریومها در حین عفونت به جای چرخه کربس از چرخه گلی اکسالات استفاده میکنند (Barrera., 2007).
به خاطر وجود مایکولیک اسید41 در دیواره سلولی مایکوباکتریومها، به صورت یک لایه محافظ میباشد که باکتری را در مقابل دزانفکتانها، ترکیبات سمی و آنتیبیوتیکها مقاوم میکند (Neonakis I.K. et al., 2008).
در انتقال مواد غذایی در مایکوباکتریومها غشاء داخلی و غشاء خارجی دخالت دارند.
2– 7– 1. انتقال مواد غذایی توسط غشاء خارجی
انتقال ترکیبات هیدروفیلیک
پورینها پروتئینهای غیراختصاصی میباشند که تشکیل کانالهایی را میدهند که در انتقال ترکیبات هیدروفیلیک در باکتریها نقش دارند اولین پورین کشف شده در مایکوباکتریومها mspA میباشد و حذف آن در مایکوباکتریوم اسمگماتیس جذب سفالوسپورین و گلوکز را به ترتیب 9 و 4 برابر کم میکند و حذف آن سبب کاهش رشد میکروبها میشود . (Stahl C. et al., 2001)
انتقال ترکیبات هیدروفوبیک
ترکیبات هیدروفوبیک (غیر الکترولیتها) به راحتی میتوانند از غشاء خارجی عبور کنند با توجه به اینکه غشاء خارجی به صورت نامتقارن و هیدروفوب میباشد و بیشترین نقل و انتقال در غشاء خارجی در دمای 70-60 درجه سانتیگراد صورت میپذیرد و در این دما لیپیدها بیشترین کاهش سیالیت غشاء را دارند. و مایکولیک اسید نقش زیادی در میزان سیالیت غشاء دارد و مواد هیدروفوبیک جهت عبور از غشاء باید ابتدا در چربی حل شوند و به علت انتقال راحتتر چربیها نسبت به مواد قندی این ترکیبات به عنوان منبع کربن میباشند و مشخص میشود که چرا آنزیم ایزوسیترات لیاز (isocitrate lyase) جهت رشد و بقاء M. tuberculosis در درون ماکروفاژ لازم میباشد و بیان ژنهایی که در اکسیداسیون اسیدهای چرب نقش دارند افزایش مییابد .( Liu J. et al., 1995)
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلی
2-7-2-1. انتقال ترکیبات حاوی کربن
کربوهیدراتها
سیستم ABC و FMS در انتقال کربوهیدارتها در مایکوباکتریومها دخالت دارند به اثبات رسیده است که سیستمهای ABC که در انتقال کربوهیدراتها نقش دارند در افزایش ویرولانسM. tuberculosis در موش نیز نقش دارند با توجه به اینکه در شرایط در شیشه گلیسرول به عنوان منبع کربن میباشد ولی هیچگونه پرمئازی در رابطه با آن تا به حال شناخته نشده است (Schanappinger D. et al., 2003).
انتقال ترکیبات حاوی کربن– لیپید
بعد از عفونت، منبع کربن از کربوهیدراتها به لیپیدها تغییر میکنند و آنزیمهای ایزوسیترات لیاز و مالئاتسنتتاز maleate synthesis)) جهت ویرولانس لازم میباشند و این به آن معنا میباشد که لیپیدها در حین عفونت به عنوان منبع کربن در مایکوباکتریومها میباشند و چرخه گلیاکسالات ضروری میباشند و بتا اکسیداسیون لیپیدها رخ میدهد .(Paula S. et al., 1996)
2-7-2-2. انتقال ترکیبات غیر کربن
فسفر جهت تامین سنتز DNA و فسفولیپیدها در داخل باکتری ضروری میباشد و فسفر در داخل ماکروفاژها جهت استفاده مایکوباکتریومها محدود میباشد جهت رشد و تکثیر مایکوباکتریومها در داخل ماکروفاژها ضروری میباشد و بعد از ایجاد عفونت بیان ژنهایی که در انتقال فسفر به داخل میکروب نقش دارند افزایش مییابد و پورینها قادر به انتقال فسفر به داخل باکتری میباشند (Wheeler P.R. et al., 1990).
انتقال سولفور
سولفور جهت شروع ترجمه و مسیرهای احیایی در داخل سلول باکتری ضروری میباشد و در حالت در شیشه، متیونین تامین کننده یون سولفات میباشد ولی در شرایط زنده متیونین بیشتر تامینکننده یون سولفور میباشد و ژنهای cysA و subl در واقع به عنوان ژنهای کد کننده انتقال متیونین میباشند و جهش در این ژنها هیچ تاثیری در بقاء مایکوباکتریومها ندارد پس مشخص میشود که یک پرمئاز سولفات را درM. tuberculosis میتوان پیشبینی کرد که جهش ژنهای cysA و subl را جبران کند (Braibant M. et al., 1996).
انتقال نیتروژن
در بسیاری از باکتریها آمونیوم به عنوان منبع ازت شناخته شده است در محیطهایی با غلظت بالای آمونیوم، گاز آمونیاک از غشاء عبور کرده و ازت سلول را تامین میکند ولی در حالت کمبود آمونیوم محیط باعث سنتز ژن amtB میشود و همولوگ این ژن درM. tuberculosis وجود دارد (Content J. et al., 2005) و در داخل ماکروفاژ که NO تولید میشود اگرNO تولید شود تولید نیترات میکند که یک منبع ازت برای باکتری در داخل ماکروفاژ میباشد در داخلM. tuberculosis 4 ژن بنامهای narU و nark1-3 وجود دارد که در وارد کردن نیترات و خروج نیتریت نقش دارند زیراM. tuberculosis قادر به احیای نیتریت نمیباشد و انباشتگی آن برای سلول سمی میباشدNolden L. et al., 2001) ). در شرایط کمبود اکسیژن و در هنگام انتقال الکترون از سیتوکروم اکسیداز نیترات به عنوان گیرنده نهایی الکترون به جای اکسیژن قرار میگیرد و انتقال نیترات در این این شرایط توسط nark2 انجام میشود و بیان این ژن توسط سیستم DosR/DouR کنترل میشود که در پاسخ هیپوکسی و NO میزان بیان nark2 را افزایش میدهد (Braibant M. et al., (1996.
انتقال کاتیونها
یونهای فلزی از جمله آهن، مس و روی نقش ساختاری و کاتالیکی در متالوپروتئینها42 و آنزیمها دارند در مایکوباکتریومها دو ژن در رابطه با ذخیره سازی و انتقال یونهای فوق شناخته شده است آهن در همه آنزیمهایی که عملکرد احیایی دارند وجود دارد سیدروفورها در انتقال و ذخیره آهن در میکروب سل نقش دارند و به دو شکل قطبی و غیرقطبی وجود دارند و شکل غیرقطبی آن مایکوباکتین (سیدروفورهای حاوی سالسیلات) میباشد که در ذخیرهسازی آهن در میکروب نقش دارد و شکل قطبی آن به صورت کربوکسی مایوباکتین میباشد که در نقل و انتقال آهن نقش دارد . (Lichtinger T. et al., 1999) در خارج از باکتری Fe3 به مایکوباکتین متصل میشود و به یک رسپتور ویژه که بر روی دیواره سلولی قرار دارد متصل شده و سپس از طریق ATP-binding casset وارد باکتری میشود و در داخل باکتری Fe3 متصل به مایکوباکتین احیاء شده و تبدیل به Fe2 میشود و از آن جدا میشود.
جهش در ژن کد کننده ATP-binding casset سبب مرگ میکروب نمیشود پس یکسری ژنها در رابطه با کسب آهن در وجود دارند که هنوز شناخته نشدهاند Nolden L. et al., 2001)).
2-8. فاکتورهای ویرولانس
وقتی که ذرات حاوی میکروب از طریق هوا وارد ریه میشوند امکان دارد 3 حالت پیش بیاید:
1- سیستم ایمنی تمام باسیلها را حذف میکند.
2- سیستم ایمنی میکروبها را از بین نبرده و از حالت عفونت به سرعت تبدیل به بیماری میشوند.
3- عفونت ایجاد میشود ولی فرد وارد مرحله بیماری نمیشود و میکروبها در حالت نهفته در ریه باقی میمانند.
ایجاد حالتهای فوق به توان سیستم ایمنی بدن و فاکتورهای ویرولانس میکروب بستگی دارد.
یکی ازعوامل ویرولانس در مایکوباکتریومها، آنزیم گلوتامین سنتتاز glutamine synthetase)) میباشد، این آنزیم در ساخت گلوتامین نقش دارد و حذف آن باعث کاهش تکثیر باسیل سل به میزان 10 برابر کمتر از سوش وحشی در خوکچه هندی میشود ولی در موش فقط مرگ را به تاخیر میاندازد.
آنزیم ایزوسیترات لیاز نیز یک آنزیم دخیل کننده در ویرولانس میباشد و حذف آن سبب میشود که گوکز کمتری در حین عفونت در اختیار باسیل سل قرار گیرد و جهش در ژن کد کننده مولکولهایی که در جذب و نگهداری مواد نقش دارد نیز سبب کاهش حدتM. tuberculosis میشود مانند ژنهای pstS2-pstS1-RV0072-modA که به ترتیب در جذب آهن، مولیبدن، فسفات و گلوتامین نقش دارند و حذف این ژنها سبب کاهش حدت مایکوباکتریومها میشود چندین مطالعه نشان میدهد که بین کاهش اکسیژن و ویرولانس رابطهای وجود دارد و کاهش اکسیژن سبب افزایش ویرولانس میشود (Comacho L. et al., 1999).
2-9. ديواره سلولي
ضخامت ديواره سلولي حدود 100 تا 200 آنگستروم است.



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید