دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم دارویی
دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))
گرایش: سلولی و مولکولی
عنوان:
بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد كروموزم X‌و Y تحت تأثير برخي عوامل محيطي در گونه گاو با استفاده از تكنيك Real-Time PCR
استاد راهنما:
جناب آقای دکتر فرید حیدری
اساتید مشاور:
جناب آقاي مهندس احسان هاشمي
سركار خانم دكتر طاهره ناجي
نگارش:
مهدیّه صفّاری
شماره پایان نامه: 62 ز س سال تحصیلی93-1392
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم دارویی
دانشکده علوم و فناوری های نوین
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))
گرایش: علوم سلولی و مولکولی
عنوان:
بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد كروموزم X‌و Y تحت تأثير برخي عوامل محيطي در گونه گاو با استفاده از تكنيك Real-Time PCR
نگارش:
مهدیّه صفّاری
بهمن 1392
هیأت داوران:
1- دکتر امیر میمندیپور
2- دکتر سپیده اربابی
تقديم به :
به پدرم، به مردانه‌ترين دست‌هايي كه تنها بود ولي دستهايم را تنها نگذاشت.
به مادرم، كه آرزوهايش را تنها گذاشت تا دلگرميم باشد.
به هر دوي آنها كه تمام لحظه‌هايشان دلواپس لحظه لحظه‌هايم بودند.
كه نبض احساسشان، تپش اضطراب‌هايم و آرامش شادي و موفقيتم بود.
كه زندگيشان را به پاي من و غم و شاديم دادند.
زندگي و خوشبختي همينجاست:
ميان دو احساس بي‌نظير كه خداوند هديه داده است.
تقديم به شما، شايد كه جبران ذره‌اي از اين بيست و شش سال باشد.
قدرداني:
حال كه توفیق آن را داشته‌ام كه بتوانم گوشه‌اي ناچيز از درياي بزرگ آفرینش را ورق بزنم و مقطع كارشناسي ارشد را با ارائه اين مجموعه به پايان برسانم، ذهن كوچكم جز اين در سطورش مرور نمي‌شود: قدرداني از خوبان.
بدون ترديد تهيه اين پايان‌نامه بدون كمك استاد راهنماي گرانقدرم جناب آقاي دكتر فريد حيدري كه با ايثار ،با صبوري و بخشش و با مهر و محبت آموزگاري، مرا از نور علم و معرفت خويش بهره‌مند ساختند، امكانپذير نبود. از ايشان به خاطر الطاف بزرگ و بي مثالشان قدرداني مي‌كنم.
و سپاس فراوان دارم از جناب آقاي مهندس احسان هاشمي كه مشاوره پايان‌نامه را پذيرفته و از راهنمايي‌هاي خود من را بهره‌مند كردند.
لازم است از سركار خانم دكتر طاهره ناجي و جناب آقاي دكتر مهدي شمس آرا به جهت حمايت و ياري بي منتشان نيز كمال تشكر را به جا آورم.
و در آخر سپاس دارم از پدر و مادر و خواهر عزیزم و دوستان بزرگوارم ،جناب آقای احسان جهانگیریان ،سرکار خانم مارال طاووسی و خانمها فاطمه فرزانه ، زهره میرزاپور و پروین ولی الّهی كه همیشه در کنارم بودند و تنهايم نگذاشتند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چكيده فارسي 1
مقدمه 2
فصل اول: كليات
پیشگفتار 4
1-1- آناتومي دستگاه تناسلي دام نر 5

1-1-1- اسپرماتيك كورد (بند بيضه) 6
1-1-2- اسكروتوم(كيسه بيضه) 6
1-1-2-1- ماهيچه دارتوس 7
1-1-2-2- تونيكا واژنياليس 7
1-1-3- بيضه‌ها 8
1-1-4- اپيديدیم 10
1-1-5- غدد ضميمه تناسلي 12
1-1-5-1 آمپولا 12
1-1-5-2- وزيكول سمينال 12
1-1-5-3- پروستات 13
1-1-5-4- غدد كوپر 13
1-1-6- آلت تناسلي نر 14
1-2- فيزيولوژي دستگاه تناسلي دام نر 15
1-2-1- اسپرماتوژنز 15
1-2-1-1- اسپرماتوسيتوژنز 15
1-2-1-2- اسپرميوژنز 15
1-2-1-3- روند كلي اسپرماتوژنز 16
1-2-2- اسپرم 20
1-2-3- مايع مني 21
1-3- نسبت جنسي 21
1-3-1- مقدمه 21
1-3-2- ژنتيك دام نر 22
1-3-3- تفاوت اسپرم‌هاي واجد كروموزوم X و Y 23
1-3-4- تعريف نسبت جنسي 25
1-3-5- اهميت كنترل نسبت جنسي 26
1-3-6- عوامل موثر بر انحراف نسبت جنسي 27
1-3-6-1- عوامل ژنتيكي و فيزيولوژيكي 27
1-3-6-2- عوامل محيطي 28
1-3-7- روش‌هاي تعيين نسبت جنسي اسپرم 28
1-4- واکنش زنجیرهای پلیمراز کیفی( PCR) 29
1-5- واکنش زنجیرهای پلیمرازکمّی((Real-Time PCR 31
1-5-1- تعریف واکنش (Real-Time PCR) 31
1-5-2- مزایای واکنش Real-Time PCR 31
1-5-3- مراحل اصلی واکنش Real-Time PCR 32
1-5-4- روشهای انجام واکنش Real-Time PCR 32
1-5-4-1- قالب غیر اختصاصی Nonspecific Format 32
1-5-4-2- قالب اختصاصی Specific Format 34
1-5-4-2-1- شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan 35
1-5-4-2-2- شناساگرهای بیکون مولکولی 37
1-5-4-2-3- سیستم شناساگر FRET 38
1-5-4-2-4- شناساگرهای عقربي 39
1-5-4-2-5- سایر سیستمها 40
1-5-5- برخی مفاهیم و اصطلاحات در تکنیک Real-Time PCR 41
1-5-5-1- منحنی تکثیر 41
1-5-5-2- گزارشگر نرمالشده((Rn 43
1-5-5-3- چرخه آستانه( (CT 44
1-5-5-4- منحنی ذوب 45
1-5-5-5- منحنی استاندارد 47
1-5-6- آناليز داده‌هاي کمي 49
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1- مطالعات پیرامون نسبت جنسی 51
2-2- مطالعات روی روشهای تعیین نسبت جنسی 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- زمان و محل انجام تحقیق 58
3-2- مراحل انجام کار 58
3-2-1- تهیه اسپرم 58
3-2-2- استخراج DNA از سلولهای اسپرم 59
3-2-2-1- مواد و لوازم استخراج DNA 59
3-2-2-2- روش کار برای استخراج DNA 60
3-2-2-2-1- شستشوی اسپرم 60
3-2-2-2-1-1- ساخت محلول PBS 60
3-2-2-2-1-2- شستشو 61
3-2-2-2-2- پروتئینزدایی 62
3-2-2-2-2-1- ساخت محلول Lysis Buffer 62
3-2-2-2-2-2- رسوب پروتئینها 62
3-2-2-2-3- جداسازی DNA 63
3-2-2-2-4- تعیین غلظت DNA 64
3-2-2-2-4-1- استفاده از ژل آگارز 64
3-2-2-2-4-1-1- مواد و لوازم ساخت ژل آگارز 64
3-2-2-2-4-1-2- روش کار با ژل آگارز 65
3-2-2-2-4-2– استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومترِ نانودراپ 66
3-2-3- واکنش PCR کیفی 66
3-2-3-1- هدف از واکنش PCR کیفی 66
3-2-3-2- مواد و لوازم برای واکنش PCR کیفی 66
3-2-3-3- روش انجام واکنش PCR کیفی 67
3-2-3-3-1- طراحی آغازگر 67
3-2-3-3-2- رقیقسازی آغازگرها 68
3-2-3-3-3- محاسبه مقادیر واکنشPCR کیفی 69
3-2-3-3-4- تعیین شرایط واکنشPCR کیفی 70
3-2-3-3-5- آمادهسازی مخلوط واکنشPCR کیفی 70
3-2-3-3-6- الکتروفورز محصولات PCR کیفی 71
3-2-4- واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-1- – هدف از انجام واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-2- مواد و لوازم برای واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-3- روش انجام واکنش Real-Time PCR 72
3-2-4-3-1- رقیقسازی آغازگرها 72
3-2-4-3-2- محاسبه مقادیر در واکنش Real-Time PCR 73
3-2-4-3-3- تعیین شرایط دمایی و زمانی واکنش Real-Time PCR 73
3-2-4-3-4- رسم منحنی استاندارد از طریق واکنش Real-Time PCR 74
3-2-4-3-5- بررسی CT و TM از طریق واکنش Real-Time PCR 74
3-2-4-3-6- آمادهسازی مخلوط واکنش Real-Time PCR 76
3-2-4-3-7- آنالیز دادههای واکنش Real-Time PCR 76
فصل چهارم : نتایج
4-1- نتایج استخراج DNA 78
4-1-1- نتیجه الکتروفورز محصولات استخراجDNA. 78
4-1-2- نتیجه غلظتخوانی با دستگاه نانودراپ 79
4-2- نتیجه الکتروفورز محصولات PCR. 80
4-3- نتایج حاصل از Real-Time PCR.. 82
4-3-1- منحنی استاندارد……………………………………………………………………………………. 82
4-3-2- منحنی ذوب و محاسبه TM…………………………………………………………………… 83
4-3-3- منحنی تکثیر و محاسبه CT…………………………………………………………………. .87
4-3-4- نتیجه الکتروفورز محصولات Real-Time PCR……………………………………….. .90
4-3-5- آنالیز کمّی دادهها………………………………………………………………………………….. 94
فصل پنجم : بحث وپیشنهادات
5-1- بحث ………………………………………………………………………………………………. .99
5-2- پیشنهادات……………………………………………………………………………………. 102
منابع 103
چکیده انگلیسی 106
ضمایم 108
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول(3-1):شماره ثبت شده دام روی پایوتهای محتوی مایع منی………………………….………. 58
جدول(3-2): مواد تشکیل دهنده محلول PBS ………………………………………………………… 60
جدول(3-3): مواد تشکیل دهنده محلول Lysis Buffer ………….………………………………… 62
جدول(3-4): اطلاعات مربوط به آغازگرها ……………………………………………………………….. 68
جدول(3-5): مقادیر مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 69
جدول(3-6): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR ……………………………………………………. 70
جدول(3-7): مقادیر مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 73
جدول(3-8): شرایط دمایی و زمانی واکنش PCR Real-Time ……….…………………….…… 74
جدول (4-1):غلظت DNA ( ng.µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل سرد…….…………………….… 79
جدول (4-2): غلظت DNA ( ng.µl-1 ) برای 7 رأس گاو در فصل گرم…….…………….………… 79
جدول (4-3) : محاسبه میانگین عدد CT بین دو تکرار در هر نمونه……….…………….………..… 95
جدول (4-6) : عدد مقیاس مطلق(تفاوت عدد الگوی اولیه ژن SRY و PLP ….………………… ………………97
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل (1-1) : اسپرماتیک کورد(بند بیضه) …………………………………………………………… 6
شکل (1-2) : اسکروتوم (کیسه بیضه) ………………………………………………………………… 7
شکل (1-3) : بیضه ها در گاو …………………………………………………………………………. 8
شکل (1-4) : بیضه ها ولوله های اسپرم ساز و شبکه رته تستیس ………………………………… 10
شکل (1-5) : اپیدیدیم ………………………………………………………………………………… 11
شکل (1-6) : غدد ضمیمه تناسلی …………………………………………………………………… 13
شکل (1-7) : آلت تناسلی گاو نر …………………………………….……………………………… 14
شکل (1-8) : اسپرماتوژنز ……………………………………………………………………………… 16
شکل (1-9) : اسپرماتوژنز و هورمونها ………………………………………………………………. 17
شکل (1-10) : مراحل سلولی اسپرماتوژنز …………………………………………………………… 19
شکل (1-11) : اسپرم …………………………………………………………………………………. 20
شکل (1-12) : کاریوتیپ گاو ………………………………………………………………………… 22
شکل (1-13) : اسپرم واجد کروموزوم Y و X ……………………………………………………… 24
شکل( 1-14) : مکانیسم عمل رنگ SYBR-Green طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)……33
شکل( 1-15) : مکانیسم عمل شناساگرهای دوسویه نشاندار یا شناساگرهای TaqMan ………………..36
شکل( 1-16) : مکانیسم عمل شناساگرهای بیکون مولکولی طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)…….… 37
شکل( 1-17) : مکانیسم عمل شناساگر FRET طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR) ……… 38
شکل( 1-18) : مکانیسم عمل شناساگر عقربي طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)…..……… 40
شکل (1-19) : منحنی تکثیر در واکنش Real-Time PCR ………………………………….. 42
شکل (1-20) : رنگ مرجع خنثی) (ROX ……………………………………………………… 43
شکل (1-21) : منحنی تکثیر و نمایش CT ………………………………………………………. 44
شکل (1-22) : منحنی ذوب و Tm ………………………………………………………………… 46
شکل (1-23) : منحنی استاندارد ……………………………………………………………………. 48
شکل(3-1):پایوتهای محتوی مایع منی …………………………………………………………… 58
شکل (4-1) : نتایج حاصل از استخراج DNA …………………………………………………… 78
شکل( 4-2 ): نتایج حاصل از PCR ……………………………………………………………….. 81
شکل (4-3) : منحنی استاندارد …………………………………………………………………….. 82
شکل( 4-6 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر SRY در فصل گرم …….. 84
شکل( 4-7 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر SRY در فصل سرد ……. 84
شکل( 4-8 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PLP در فصل گرم ……. 85
شکل( 4-9 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PLP در فصل سرد ……. 85
شکل( 4-10 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PARدر فصل گرم……. 86
شکل( 4-11 ): منحنی ذوب و میزان Tm محاسبهشده برای آغازگر PARدر فصل سرد……. 86
شکل( 4-12 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل گرم ………….87
شکل( 4-13 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر SRY در فصل سرد………… 87
شکل( 4-14 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل گرم ………… 88
شکل( 4-15 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PLP در فصل سرد ………… 88
شکل( 4-16 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل گرم………… 89
شکل( 4-17 ): منحنی تکثیر و میزان CT مربوطه برای آغازگر PAR در فصل سرد .……… 89
شکل( 4-18 ) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر SRY …………………………………. 91
شکل (4 – 19): نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر SRY ………………….………..……… 91
شکل(4-20) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر PLP ………..…………………..………… 92
شکل(4-21) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر PLP …………………………..…………92
شکل(4-22) : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر ..………………………..…………PAR 93
شکل(4-23) : : نتیجه واکنش qPCR برای آغازگر .……………………..…………PAR…… 93
شکل (4-24) : فرمولهای محاسبه و آنالیز کمّی آزمایش …………………………………..… 96
چکیده فارسی:
جنسیت موالید در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار حائز اهمیت است.افزایش بهرهوری اقتصادی و نیز کنترل بیماریهای ژنتیکی وابسته به جنس ارتباط مستقیمی با جنسیت موالید دارد.نسبت جنسی موالید اتفاقی نبوده و عوامل مختلفی در تعیین جنسیت موالید نقش دارد.یکی از این عوامل،نسبت جنسیتی اسپرمهای واجد کروموزوم X و Y در انزالِ طبیعی است. مهم‌ترین عوامل محیطی که احتمال می‌رود روی این نسبت تاثیر داشته باشد،استرس گرماییو تفاوت‌های فردی می‌باشد. در مطالعه حاضر به بررسی تغییر نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم Y به اسپرم‌های واجد کروموزومX در انزال گاو نر تحت تاثیر تنش گرمایی و بررسی تفاوت‌های فردی با استفاده از تکنیک Real-Time PCR پرداخته شد. به این منظور از 7 رأس گاو نر بالغ در دو فصل گرم (تحت تأثیر استرس گرمایی) و سرد نمونهگیری به عمل آمد و پس از استخراج محتوی ژنتیکی، با استفاده از سه جفت آغازگر ژنهای SRY (شاخص کروموزوم Y)،PLP (شاخص کروموزوم X ) و PAR (ژن خانهدار)و با استفاده از روش Q-PCR مورد ارزیابی کمی قرار گرفتند.نتایج این تحقیق نشان داد که نسبت جمعیتی کروموزومهای واجد X و Y در انزال طبیعی در میان دامها یکسان نیست.همچنین نشان داد که تنش گرمایی با افزایش نسبت جمعیتی کروموزومهای Y رابطه دارد.کلمات کلیدی: نسبت جنسی، اسپرم، استرس گرمایی، تفاوت فردی، Real-Time PCR
مقدمه
امروزه در جهت توسعه صنعت دامپروری در راستایبهبود اقتصادی، بهبود ژنتیکی و سلامت دام،یکی از بهترین راهها کنترل جنس موالید و نسبت جنسی است. یکی از بهترین راه‌ها برای بررسی نسبت جنسی موالید و کنترل آن تعیین جنسیت اسپرم‌ها و نسبت آنها است. این نسبت تحت تأثیر عوامل مختلفی از جمله عوامل محیطی و ژنتیکی است. مهم‌ترین عواملی که ممکن است بر این نسبت تأثیر معنی‌داری داشته باشد، استرس گرمایی1 و تفاوت‌های فردی می‌باشد.
به این منظور مطالعه حاضر به بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم Y به اسپرم‌های واجد کروموزوم X در انزال گاو در دامهای مختلف و تحت تاثیر تنش گرمایی با استفاده از تکنیک Real-Time PCR می‌پردازد.
در این آزمایش از روش Real-Time PCR با ماده شناساگر SYBR Green و ارزیابی نسبی استفاده شد. به همین جهت 3 آغازگر (Primer) تحت عنوان SRY (شاخصه کروموزوم(YPlP(شاخصه کروموزوم X) و PAR (به عنوان ژن خانه‌دار2) که کنترل داخلی محسوب می‌شود،طراحی شد.
فصل اول
کلیات
پیشگفتار:
نسبت جنسی موالید یک شاخص سرشماری مهم است که از اواخر قرن هفدهم مورد بررسی قرار گرفته است. اگر بتوانیم این نسبت را کنترل کنیم یا نتایج نسبت جنسی را تغییر دهیم برای اصلاح نژاد دام در صنعت دامپروری و از نظر اقتصادی بسیار مفید خواهد بود. تئوری نسبت جنسی و توضیح علل و مکانیسم‌های آن هنوز موضوعی قابل بحث است[28 ، 27].
در صنعتپرورش گاو گوشتی تولید گوشت بدون چربی بر پایه تولید گوساله نر می‌باشد.اما در صنعت گاو شیری تولید گوساله ماده به منظور حفظ گله حائز اهمیت است. بنابراین کنترل نسبت جنسی در حیوانات جایگاه بالایی در برقراری تعادل نسبت به نرها و ماده‌ها در گونه‌های در حال انقراض،تسریع روند اصلاح ژنتیکی دام‌ها،تسهیل مدیریت دامپروری و بهره‌های فراوان در دامپروری دارد[27, 3].
در پستانداران در جنس ماده دو کروموزومجنسی مشابه (XX) حضور دارد امادر موجود نر به جهت دارا بودن دو کروموزوم جنسی متفاوت (XY) معین‌کننده جنس فرزند است[11, 10].
پس اگر بتوانیم عوامل موثر بر تغیر نسبت جنسیت اسپرم‌ها (حاوی X و یا Y بودن) را بررسی کنیم و این عوامل را کنترل کنیم،در واقع میتوانیم نسبت جنسی را تحت کنترل بگیریم. دیده شده است که عوامل گوناگونی از جمله محيط و وراثت می‌توانند روی جنسیت اسپرم‌ها موثر باشند. یعنی اینکه منجر به این امر می‌شود که نسبت جنسی اسپرم‌ها در انزال که به طور تئوری 1:1 است اما در عمل اینگونه نیست را دستخوش تغییر کند[31, 27, 8].
بررسی نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم X به اسپرم‌های واجد کروموزوم Y با استفاده از روش‌هایی نظیر فلوسیتومتری،PCR، Real-Time PCR و FISH انجام می‌گیرد[31،25، 17].
بدین منظور در این پایان‌نامه برآنیم که
اثر دو عامل تنش گرمایی و تفاوت‌های فردی را روی تغییر نسبت جنسی اسپرم‌ها از 1:1 به مقداری متفاوت با استفاده از تکنیک Real-Time PCR بررسی کنیم.
پیش‌بینی ما این است که اولاً در فصل گرما و در تنش گرمایی تعداد اسپرم‌های واجد کروموزوم Y نسبت به اسپرم‌های واجد کروموزوم Xدر انزال گاوها بیشتر است و ثانیاً این نسبت در گاوهای متفاوت با هم فرق دارد(تفاوت فردی)،در این تحقیق بررسی ما بر روی مایع منی 8 گاو است که یک بار در فصل گرما و یک بار در فصل سرما در آنها انزال صورت گرفته است،می‌باشد.
1-1- آناتومی دستگاه تناسلی دام نر
(Male Reproductive Anatomy)
بخش‌های اساسی دستگاه تولیدمثل دام نر شامل اسپرماتیک کورد3 (بند بیضه)،اسکلروتوم4 (کیسه بیضه)،بیضه5،اپیدیدیم6،غدد ضمیمه تناسلی7،آلت تناسلی8 می‌باشد[42, 37]، که به اقتضای پایان‌نامه به اختصار به هر یک اشاره خواهد شد.
1-1-1- اسپرماتیک کورد (بند بیضه)
ساختاری طنابی شکل در جنس نر که توسط مجاری دفران9 و بافت‌های اطراف آن شکل گرفته است و از سمت شکم به هر بیضه می‌رسد و شامل انواع سرخرگ‌ها10، اعصاب مختلف11، شبکه پمپینی فورم12، عروق لمفاتیک13و عضله کرماستر14 و … است[42، 37، 1].
1-1-2- اسکروتوم (کیسه بیضه)
در بسیاری از پستانداران از جمله گاوها، بیضه‌ها در حفره‌ای،بیرون از بدن قرار دارند که به آن اسکروتوم یا همان کیسه بیضه گفته می‌شود. در واقع این کیسه با یک دیواره به دو حفره تقسیم می‌شود و هر یک از بیضه‌ها در یکی از این حفرات قرار می‌گیرند.
دیواره اسکروتوم شامل پوست رویی (ادامه پوست شکم)، ماهیچه‌ای به نام دارتوس15 و بخشی به نام تونیکا واژینالیس16 است. نقش این کیسه حفاظت از بیضه‌ها و تنظیم دمای مناسب برای عملکرد آنهاست. چرا که تولید اسپرم در بیضه‌ها حدود 7-4 درجه پایین‌تر از دمای بدن رخ می‌دهد[42, 1].
1-1-2-1- ماهیچه دارتوس
لایه‌ای است ماهیچه‌ای که در زیر پوست کیسه بیضه قرار دارد و با انقباض و انبساط خود،باعث می‌شود تا بیضه‌ها در هوای گرم به طرف خارج از بدن و در هوای سرد به طرف داخل بدن برای تنظیم درجه حرارت بیضه‌ها،کشیده شوند. این عضله غیر ارادی بوده و در دیواره بین دو نیمه راست و چپ اسکروتوم کشیده شده است[42, 1].
1-1-2-2- تونیکا واژینالیس
یک شبکه خونی که بیضه‌ها را پوشانده است. در واقع کیسه‌ای است از غشای حاوی سرم و حالت آبکی دارد. کنار قدامی به سطوح داخلی و خارجی هر بیضه را می‌پوشاند[37].
1-1-3- بیضه‌ها
بیضه‌ها در گاو بیضی شکل می‌باشند. طول آنها حدود 15-10 سانتی‌متر و عرض آنها حدود 8-5 سانتی‌متر است. این بیضه‌ها حدود 500-400 گرم وزن دارند. بیضه‌ها توسط طناب‌های اسپرماتیک در اسکروتوم معلق (آویزان) می‌باشند.
این اندام دارای دو وظیفه اصلی است:
1- تولید اسپرم
2- تولید هورمون‌های جنسی نر (آندروژن‌ها)17
هر بیضه داخل یک بافت پیوندی سفید رنگی به نام تونیکا آلبوژینا18 است که خود توسط تونیکا واژینالیس پوشیده شده است و در قسمت کنار خلفی بیضه، به صورت یکتورفتگی عمودی و ناقص و ضخیم درمی‌آید که به آن ناف یا مدیاستینوم بیضه19 گفته می‌شود و عروق و مجاری بیضه از این قسمت وارد بیضه می‌شوند.تعداد زیادی سپتوم ناقص (ترابکول) از مدیاستینوم بیضه به درون آن نفوذ کرده و در نهایت داخل بیضه را به حدود 300-200 لوبول هرمی شکل تقسیم می‌کند.
هر لوبول حاوی 3-2 عدد لوله اسپرم‌ساز20 پر پیچ و خم و بخشی به نام بافت بینابینی می‌باشد. در واقع لوله‌های اسپرم‌ساز حاصل نفوذ بخشی از کپسول به داخل بافت بیضه‌ها می‌باشند و حدود 70 تا 90 درصد وزن بیضه‌ها را تشکیل می‌دهند. انتهای لوله‌های اسپرم‌ساز در راس لوبول‌ها به صورت لوله مستقیم به هم می‌رسند و سپس وارد مدیاستینوم بیضه می‌شود. در مدیاستینوم بیضه،این لوله‌ها با هم پیوند (آناستوموز) شده و شبکه بیضه‌ای به نام رته تستیس21 را تشکیل می‌دهند(در مرکز بیضه) [42, 1].
سلول‌های تولیدکننده اسپرم (اسپرماتوگونیا) در سرتاسر غشای پایه لوله‌های اسپرم‌ساز قرار گرفته‌اند و توسط سلول‌های سرتولی محافظت می‌شوند.
همانطور که سلول‌های اسپرمی تقسیم و بالغ می‌شوند از سمت غشا به لومن در لوله‌های اسپرم‌ساز جابجا می‌شوند و سپس به شبکه رته‌تستیس در مرکز بیضه منتقل می‌شوند تا به مجاری افران و سپس دفران برده شوند و از آنجا به اپیدیدیم بروند.
بافت بینابینی دربرگیرنده عروق خونی،اعصاب و یک سری سلول‌های متمایز شده به نام سلول‌های لایدیگ22 می‌باشند که هورمون‌های جنسی تولید می‌کنند که به خون و سلول‌های سرتولی منتقل می‌شوند[15].
1-1-4- اپیدیدیم
اپیدیدیم ساختاری فشرده و پهنی است که در اتصال و نزدیکی یک سمت بیضه کشیده شده است. این لوله درهم پیچیده دارای 3 قسمت سر23، تنه24 و دم25 می‌باشد.
درون این لوله، حدود 160-130 توبول وجود دارد که نهایتاً به یک لوله به نام وازودفران26 ختم می‌شوند.
حدوداً 45 تا 50 روز زمان لازم است تا اسپرم‌ها در لوله‌های اسپرم‌ساز شکل بگیرند و به اپیدیدیم وارد شوند و در آنجا بالغ و آماده برای انزال27 شوند[15].
حدود یک هفته از زمان گفته شده در اپیدیدیم سپری می‌شود تا اسپرم‌ها به اسپرم‌های بالغ و بارور تبدیل گردند[42, 15].
اسپرم‌ها که در اپیدیدیم ذخیره شده‌اند،نسبت به آن دسته که تازه وارد آن شدند و به عبارتی اخیراً شکل گرفته‌اند،به تنش‌های گرمایی مقاوم‌تراند.
در مدت زمان 45 تا 50 روز که اسپرم‌ها در حال ساخته شدن هستند. قدرت باروری موجود نر کاهش خواهد داشت اما بعد از آن قدرت آن بسیار زیاد خواهد شد.
از آنجایی که اپیدیدیم تنها مجرای خروجی اسپرم‌های تولید شده در بیضه می‌باشد،هرگونه انسداد آن اهمیت ویژه‌ای خواهد داشت. گاهی یک انسداد موقت که ایجاد تورم می‌کند. می‌تواند منجر به آسیب و عفونت گردد و نهایتاً عبور اسپرم‌ها را از این لوله مسئله‌ساز کند[42].
1-1-5- غدد ضمیمه تناسلی
این غدد در امتداد میزراه لگنی28 قرار گرفته‌اند. وظیفه آنها تولید مایعی است که وارد مجرای تناسلی شده و با اسپرماتوزوآ مخلوط می‌گردد و تشکیل مایع منی29 را می‌دهد.
این غدد شامل آمپولا،وزیکول سمینال30،پروستات31 و غدد کوپر32 می‌باشد[37, 1].
1-1-5-1- آمپولا
در قسمت انتهایی مجرای و ابران قرار گرفته است و کار آن ذخیره اسپرماتوئید و دخالت در تشکیل پلاسمای مایع منی است[37].
1-1-5-2- وزیکول سمینال
این غده در گاو حالت سفت و لوبوله دارد و در نزدیکی آمبولا در کف لگن قرار گرفته است. این غده دارای دو بخش است که طول هر یک 5-4 سانتی‌متر می‌باشد و هر کدام از طریق یک مجرا به میزراه می‌ریزند.ترشحات آن آبکی و شفاف است و مواد مغذی و بافری برای منی را فراهم می‌کند[42, 37].
1-1-5-3- پروستات
این غده در بخش گردن مثانه در کف لگن قرار گرفته است و به پیشابراه لگنی مربوط می‌شود. این غده ترشحاتش را به هنگام انزال به منی اضافه می‌کند. در گاو رشد کمی دارد و حجم ترشحاتش کم است[42, 37].
1-1-5-4- کوپر
یک جفت غده هستند که به صورت پشتی در پیشابراه لگنی کشیده شده‌اند. محکم و کوچک هستند و یکی از اعمال مهم ترشحات این غدد این است که میزراه را از باقی‌مانده ادرار که برای اسپرم‌ها مضر است،پاک می‌کند. این ترشحات معمولاً از آلت تناسلی در طول تحریکات جنسی بیرون می‌چکد[42, 37].
عفونت یکی از غدد ضمیمه باعث می‌شود رنگ مایع منی زرد یا تیره شود که علت آن وجود چرک و سلول‌های فاسد است. در گاو عفونت وزیکول سمینال شایع است.
1-1-6- آلت تناسلی نر
عضو مربوط به جفت‌گیری (مقاربت جنسی)33 است. در درون این عضو در همه حیوانات اهلی دو لوله استوانه‌ای تو خالی و غار مانند وجود دارد که به هنگام تحریکات جنسی این فضا پر از خون می‌شود و در نتیجه این رخداد،نعوظ34 ایجاد می‌شود. گلنز35 مربوط به انتهای پنیس است که حاوی عصب‌های زیادی است که برای جفت‌گیری لازم هستند[42].
1-2- فیزیولوژی تولید مثل دام نر
Physiology)(Male Reproductive
1-2-1- اسپرماتوژنز36
فرآیند اصلی تولیدمثل دام نر اسپرماتوژنر نام دارد و شامل مراحل اسپرماتوسیتوژنز37 و اسپرمیوژنز38 می‌باشد که نهایتاً تولید سلول‌های اسپرماتوزوآ از اسپرماتوگونی را منجر می‌شود. در گاو این مراحل به طور کلی نیازمند 60 تا 70 روز کامل می‌باشد. گاو نر طبیعی به ازای هر گرم از بافت بیضه بین 17-12 میلیون اسپرم می‌سازد[37].در واقع این پروسه،یک پروسه طولانی است که سلول‌های اسپرماتوگونی یک سری با تقسیمات میتوز و میوز به سلول‌های هاپلوئیدی اسپرماتوزوآ تبدیل می‌شوند. این روند نیازمند بیان و ازدیاد برخی از ژن‌هاست.اسپرماتوژنر موفق نیازمند رشد و نمو طبیعی بیضه‌ها و لوله و مجاری مرتبط با آن است[24].
1-2-1-1- اسپرماتوسیتوژنز
روند تبدیل سلول‌های اسپرماتوگونیا به اسپرماتید که در بیضه‌ها صورت می‌گیرد و عمده این روند تحت اثر هورمون FSH39 که از هیپوفیز قدامی40 ترشح می‌شود، می‌باشد[37, 24].
1-2-1-2- اسپرمیوژنز
روند تبدیل اسپرماتید41 به اسپرماتوزوئید42 که در بیضه‌ها صورت می‌گیرد و عمده این روند تحت اثر هورمون FSH که از هیپوفیز قدامیو سلول‌های لیدیگ ترشح می‌شود،می‌باشد[37, 24].
1-2-1-3- روند کلی اسپرماتوژنز
قبل از انزال،سلول‌هایی که بعداً به اسپرم بالغ تبدیل می‌شوند،به ترتیب به شبکه رته تستیس،مجاری وابران،اپی دیدیم،وازودفران و لوله انزال و نهایتاً مجرای میزراه می‌روند[24].
از طرفی عملکرد طبیعی دستگاه تولیدمثلی در دام نر عمدتاً توسط هورمون‌ها کنترل می‌شود. عملکرد بیضه‌ها به عنوان یک غده باعث تولید هورمون‌های مردانه از جمله تستوسترون43 می‌شود[15].
در گاو در 4 ماهگی از غده هیپوتالاموس GnRH44 تولید می‌شود. این هورمون روی غده هیپوفیز قدامی تاثیر گذاشته و منجر به تولید هورمون‌های LH و FSH از آن می‌گردد. هورمون LH روی سلول‌های لیدیگ که در بافت بینابینی بیضه قرار دارند اثر گذاشته و منجر به تولید هورمون تستوسترون از این سلول‌ها می‌شوند که این هورمون به خون و سلول‌هایی به نام سرتولی که حضور آنها در دوران جنینی برای نمو بیضه و در دوران بلوغ برای روند اسپرماتوژنز لازم است، منتقل می‌شود[11, 13, 14]. هورمون FSH روی سلول‌های سرتولی با کمک تستوسترون رسیده از سلول‌های لیدیگ اثر گذاشته و منجر به انجام اسپرماتوژنز می‌شود[42, 24].
این هورمون‌ها توسط مکانیسم‌های فیدبکی کنترل می‌شوند و در ارتباط تنگاتنگی با هم هستند. عملکرد طبیعی آنها بسته به تعادل در میزان آنهاست.
هورمون FSH و تستوسترون با افزایش سطح cAMP، افزایش ساخت پروتئین‌ها و افزایش تولید استرادیول‌ها در سلول‌های سرتولی باعث روند اسپرماتوژنز می‌شوند[15].
-در هنگام بلوغ،اسپرماتوگونی بنیادی با انجام تقسیم میتوز هم می‌تواند اسپرماتوگونی تیپ A را ایجاد کند و هم به جهت آن که سلول بنیادی است،می‌تواند خود را بسازد45.
اسپرماتوگونی تیپ A چهار با تقسیم میتوز می‌کند. بار اول سلول‌های واسط46 را تولید می‌کند و بار دوم و سوم اسپرماتوگونی تیپ B را ایجاد می‌کند و بار چهارم اسپرماتوسیت اولیه47 ایجاد می‌شود. این روند 15 روز در گاو طول می‌کشد.
اسپرماتوسیت اولیه در 6-4 ماهگی در لوله‌های اسپرم‌ساز دیده می‌شود و با انجام تقسیم اولیه میوز48به اسپرماتوسیت ثانویه49 تبدیل می‌شوند. این مرحله نیز 15 روز طول می‌کشد.
اسپرماتوسیت ثانویه در طی 2-1 روز با انجام میوز دوم به اسپرماتید تبدیل می‌شود.
اسپرماتید یک هسته کروی دارد که به وسیله سیتوپلاسم حاوی مقادیر زیادی میتوکندری و جسم گلژی احاطه شده است. این سلول در 7-6 ماهگی در لوله‌های اسپرم‌ساز گاو دیده می‌شود. این اسپرماتید باید به اسپرماتید ثانویه تبدیل شود. سپس این سلول با از دست دادن قسمت اعظم سیتوپلاسم خود و تغییرات مورفولوژیکی و محتوایی طی اسپرمیوژنز به اسپرماتوزوآ تغییر می‌کند که تبدیل اسپرماتید به اسپرماتوزوآ که همان اسپرم بالغ است. حدود 36 روز طول می‌کشد. در مجموع کل این فرآیند در گاو نر نیازمند 70-65 روز کامل می‌باشد[24, 16].
1-2-2- اسپرم
– اسپرم سلولی است تخصص یافته است که برای انجام عمل منحصر به فرد باروری اووسیت‌ها50، تمایز پیدا کرده است. اساس ساختمانی آن در حیوانات اهلی تقریباً شبیه هم است. فقط در اندازه و شکل کمی متفاوت است. اسپرم دارای چهار بخش سر،گردن و قطعه میانی و دم است.بخش قدامی سر اسپرم که توسط کپسول آکروزومی پوشیده شده است،حاوی آنزیم برای هضم دیواره تخمک است.گردن اسپرم حاوی دو سانتریول است و بین سر و قطعه میانی قرار گرفته است.قطعه میانی، میتوکندری را دارا می‌باشد که انرژی لازم برای حرکت و اعمال متابولیکی را برعهده دارد[11]. دم،یک آکسون مرکزی دارد که توانایی تحرک به اسپرم می‌دهد[37, 1].
1-2-3- مایع منی51
مایع منی حاوی اسپرم‌ها و ترشحات مایع غدد ضمیمه‌ای است. حجم منی و تعداد اسپرم‌ها در گونه‌های مختلف گاو با هم متفاوت است. اما اغلب گاوها در هر بار انزالشان حدود 3 تا 5 میلی لیتر مایع منی دارند که تعداد یک بیلیون اسپرم در هر میلی‌لیتر52 آن وجود دارد.
اگر اسپرم‌ها مدت زمان زیادی مصرف نشوند یا به عبارتی دام لقاح نکند و فعالیت جنسی نداشته باشد،اولین انزال‌ها یا اصلاً اسپرم ندارند،تعداد کمی اسپرم دارند،اسپرم‌ها قدرت حرکت ضعیف دارند،تعداد زیادی از اسپرم‌ها غیر طبیعی هستند،اسپرم‌های مرده و یا فاسدشدنی زیاد وجود دارد. بنابراین برای ارزیابی و سنجش اسپرم‌های یک گاو بایستی چندین بار انزال تکرار شود و به بار اول نباید قانع بود[42].
1-3- نسبت جنسی53
1-3-1- مقدمه
همانطور که می‌دانیم در غالب جانداران،وجود دو جنس نر و ماده زمینه را برای تولیدمثل جنسی و در نتیجه تداوم نسل فراهم کرده است. زندگی با آمیزش دو سلول جنسی نر و ماده آغاز می‌گردد. هر کدام از دو سلول جنسی نیمی از کروموزوم یا عوامل وراثتی (نیمی از اطلاعات) یک جاندار کامل را در خود جای داده‌اند. با آمیزش دو سلول جنسی اسپرماتوزوآ54 و تخمک55، ایجاد فرزندان یا موالید می‌شود که جانداران مکملی هستند. ترکیب دو سلول هاپلوئید (n کروموزومی) ایجاد سلول دیپلوئید (2n کروموزومی) را می‌کند. این فرزندان نر یا ماده هستند[16].
در پستانداران جنس ماده دو کروموزوم جنسی مشابه (X و X) را در سلول‌های تخمک داراست اما در موجود نر دو کروموزوم جنسی متفاوت در سلول‌های اسپرم وجود دارد. (Y و X) که از نظر شکل و اندازه متفاوتند. در پستانداران،جاندار نر به جهت دارا بودن دو نوع کروموزوم جنسی،معین‌کننده جنسیت فرزند خواهد بود[27, 11, 10].
1-3-2- ژنتیک دام نر
گاو دارای 30 جفت کروموزوم است که 29 جفت غیر جنسی و 1 جفت آن جنسی می‌باشد (2n=60)، معمولاً 29 جفت غیر جنسی‌ها از نوع آکروسانتریک56 هستند و کروموزوم جنسی x از نوع ساب متا سانتریک57 است اما کروموزوم جنسی Y بسته به گونه گاو متفاوت است مثلاً در گاوهای بوس تاروس58 که گونه مورد بررسی در این پایان‌نامه است،این کروموزوم از نوع ساب متاسانتریک است[17].
1-3-3- تفاوت اسپرم‌های حاوی کروموزوم X و Y
بسته به این که کدام‌یک از کروموزوم‌ها در اسپرم حضور داشته باشد،محتوای DNA،شارژ سطحی، تحرک و برخی خواص فیزیکی مثل وزن و دانسیته و … در اسپرم‌های حاویX با اسپرم‌های حاوی Y متفاوت خواهد بود[16].
1- محتوای DNA: کروموزوم‌های X‌ از کروموزوم Y بزرگتر است. کروموزوم X از نظر اندازه، نوع و ترتیب ژن در پستانداران بسیار حفاظت شده است اما کروموزوم Y با تغییرات زیاد بیش از 1000 ژن خود را در طی تکامل از دست داده است و بسیار کوتاه شده است. حدود 4/3 – 8/2درصد ژن یا DNA کمتری در آن نسبت به کروموزوم جنسی X وجود دارد[39, 11].
هر یک میلیون سال 35 تا 60 ژن از کروموزوم Y محو شده است. علت این امر می‌تواند ساختار خاص کروموزوم Y و محل زندگی آن یعنی بیضه‌ها باشد که منجر به افزایش احتمال جهش خواهد شد[5].از جمله ژن‌هایی که فقط روی کروموزوم X وجود دارد ولی کروموزوم Y آن را ندارد می‌توان ژن PLP نام برد. (پروتئولیپید پروتئین)59. از جمله ژن‌هایی که فقط روی کروموزوم Y وجود دارد ولی کروموزوم X آن را ندارد. می‌توان SRY60 را نام برد[44، 30 ، 21].
برخی ژن‌ها هم مانند PAR61 روی هر دو کروموزوم حضور دارند[11].
2-شارژ سطحی: اسپرم حاوی کروموزوم x دارای بار الکتریکی مثبت می‌باشد و در نتیجه به سمت بار الکتریکی منفی جذب می‌شود اما در کروموزوم Y این امر صادق نیست[39, 16].
3- تحرک: سرعت حرکت اسپرم حاوی کروموزوم Y نسبت به اسپرم حاوی کروموزوم x در مایع منی بیشتر است اما به دلیل کوچک بودن،ظریف‌تر و شکننده‌تر است در نتیجه عمر آن در مایع منی کمتر از اسپرم حاوی کروموزوم x است[27, 16].
4-اسپرم حاوی کروموزوم Y می‌تواند نور فلورسنت را بعد از رنگ‌آمیزی منعکس کند اما اسپرم حاوی کروموزوم X این نور را جذب می‌کند[39, 16].اساس روش فلوسیتومتری62 که روشی برای جداسازی اسپرم‌های واجد X از اسپرم‌های واجد Y می‌باشد نیز همین جذب نور و شارژ سطحی این دو نوع کروموزوم است[42, 39, 10].
1-3-4- تعریف نسبت جنسی
در پستانداران اگر اسپرم حاوی کروموزوم X با تخمک لقاح باید تولید فرزند ماده (xx) می‌کند و اگر اسپرم حاوی کروموزوم Y،تخمک را بارور کند،تولید فرزند نر (xy) می‌کند[27, 8].در گاوها به طور تئوری نسبت اسپرم حاوی کروموزوم X به اسپرم حاوی کروموزوم Y در هر انزال 1:1 است[10].در هنگام جدا شدن کروموزوم‌ها در میوز هم، احتمال این که اسپرم حاوی کروموزوم X یا Y باشد، برابر است[35, 17].
دیده شده است که عوامل گوناگونی از جمله محیط،وراثت و تغذیه می‌تواند روی تعیین جنسیت جنین و اسپرم‌ها موثر باشد. در تحقیقات نشان داده شده است که نسبت جمعیتی اسپرم‌های واجد کروموزوم X و Y در نمونه‌ها یکسان نبوده و در برخی موارد نسبت یکی بر دیگری فزونی می‌گیرد[32, 13].
در سال 1964،سه نوع از نسبت جنسی توسط شخصی به نام Nalbandov معرفی شد.
• نسبت جنسی اولیه (PSR)63 نسبت جنسی در هنگام جفتگیری است و با نسبت زیگوت‌های نر به ماده مشخص می‌شود.
• نسبت جنسی ثانویه (SSR)64 نسبت جنسی موالید است و با نسبت نتایج نر به ماده در هنگام تولد مشخص می‌شود.
• نسبت جنسی ثالثیه (TSR)65 با نسبت تعداد نتایج نر در مقابل تعداد نتایج ماده در سن بلوغ مشخص می‌شود.انتظار می‌رود که این نسبت در جمعیت‌های بزرگ 1:1 باشد[27, 8].
1-3-5- اهمیت
همانطور که گفته شد نسبت جنسی ثانویه،نسبت جنسی موالید است که متأثر از جنسیت اسپرم است[27, 8].
نسبت جنسی موالید یک شاخص سرشماری مهم است که اواخر قرن هفدهم مورد بررسی قرار گرفته



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید