دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده
پایان نامه (یا رساله) برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته میکروبیولوژی
گرایش عمومی
عنوان
بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران
استاد راهنما
دکتر رضا رنجبر
نگارنده
سیده مرجان مجابی
بهمن ماه 1393

به نام خدا
معاونت پژوهش وفن آوری واحد دامغان
منشور اخلاق پژوهش

با یاری از خداوند سبحان واعتقاد به این که عالم محضرخداست وهمواره ناظر براعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت جایگاه دانشگاه دراعتلای فرهنگ وتمدن بشری ، مادانشجویان واعضاء هیأت علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد می گردیم اصول زیر را درانجام فعالیت های پژوهشی مد نظر قرارداده وازآن تخطی نکنیم :
1- اصل برائت : التزام به برائت جویی از هرگونه رفتار غیر حرفه ای واعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم وپژوهش ر ابه شائبه های غیرعلمی می آلایند .
2- اصل رعایت انصاف وامانت : تعهد به اجتناب ازهرگونه جانبداری غیرعلمی وحفاظت ازاموال ، تجهیزات ومنابع دراختیار
3- اصل ترویج : تعهد به رواج دانش واشاعه نتایج تحقیقات وانتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر ازمواردی که منع قانونی دارد .
4- اصل احترام : تعهد به رعایت حریم ها وحرمت ها درانجام تحقیقات ورعایت جانب نقد وخودداری ازهرگونه حرمت شکنی .
5- اصل رعایت حقوق : التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان ، حیوان ونبات ) وسایرصاحبان حق .
6- اصل راز داری : تعهد به صیانت ازاسرار واطلاعات محرمانه افراد ، سازمان ها وکشوروکلیه افراد ونهادهای مرتبط با تحقیق .
7- اصل حقیقت جویی : تلاش درراستای پی جویی حقیقت و و فاداری به آن ودوری ازهرگونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی ومعنوی : تعهد به رعایت مصالح ملی ودرنظر داشتن پیشبرد وتوسعه کشور درکلیه مراحل پژوهش
9- اصل منافع ملی : تعهد به رعایت مصالح ملی و درنظر داشتن پیشبرد وتوسعه کشور درکلیه مراحل پژوهش
نام و نام خانوادگی: سیده مرجان مجابی
تاریخ و امضاء:

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده
پایان نامه (یا رساله) برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته میکروبیولوژی
گرایش عمومی
عنوان
بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران
استاد راهنما
دکتر رضا رنجبر
نگارنده
سیده مرجان مجابی
بهمن ماه 1393
صورت جلسه دفاع
سپاس گذاری:
از خداوند متعال به خاطر فرصت دوباره ای که به من عطا فرمود تا بار دیگر ذره ای از راز خلقت شگفت انگیزش را بیاموزم، شاکر و سپاسگزارم. از پدر و مادر عزیز و گرامی ام، که از بدو تولد مرا با تمام وجود، در هر مقطع و هر زمانی ازهر لحاظ ممکن و غیر ممکن راهنمایی و حمایت نمودند، از اعماق وجودم با کلامی غیر قابل وصف، کمال سپاسگزاری را دارم. هم چنین، خداوند متعال را برای عطا کردن چنین والدینی، همیشه شاکر خواهم بود.تشكر از زحمات بي‌شائبه و راهنمايي‌هاي استاد گرانقدرم جناب آقاي دكتر رضا رنجبر که در تمامی مراحل با مهربانی و صبوری از هيچگونه مساعدت دريغ نورزيده‌اند و بحق راهنمایی مشفق و مشوقی دلسوز در تمام امورتحقیقی اینجانب بوده‌اند.
فهرست مطالب
عنوان صفحهچکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1
فصل اول : مقدمه
1-1-بیان مسئله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………2
1-2-اهمیت و ضرورت تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………3
1-3-اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4
1-4-فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..4
1-5-تاریخچه اشرشیا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5
1-5-1-خانواده انتروباکتریاسه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5
1-5-2-اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….6
1-5-3-طبقه بندی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6
1-5-3-1-ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………7
1-5-3-2-ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O…………………………………………………………………………………………………………………………………….7
1-5-3-3-ساختار آن کپسولی یا آنتی ژن K………………………………………………………………………………………………………………………………………………….8
1-5-3-4-ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H………………………………………………………………………………………………………….9
1-5-3-5-ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F……………………………………………………………………………………………………………………………………9
1-6-خصوصیات مورفولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..10
1-6-1-خصوصیات کشت و بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………11
1-6-2-مقاومت……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………12
1-6-3-ژنتیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13
1-7-بیماری زایی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13
1-7-1-فاکتورهای حدت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
1-7-1-1-کپسول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14
1-7-1-2-آندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………14
1-7-1-3-پروتئین های اتصالی فیمبریه ای………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
1-7-1-4-اگزوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15
1-7-2-1-انتروتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16
1-7-2-2-سیتوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16
1-7-2-3-وروتوکسین ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………17
1-7-2-4-آلفاهمولیزین ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17
1-7-2-5-سیدروفورها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17
عنوان صفحه1-7-3-تغییر فاز آنتی ژنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18
1-7-3-1-سیستم ترشحی نوع III …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..18
1-7-3-2-بیماری در انسان…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18
1-7-4-1-پاتوتیپ اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………19
1-7-4-2-پاتوتیپ اشرشیا کلی توکسین زای روده ای(ETEC)………………………………………………………………………………………………………………19
1-7-4-3-پاتوتیپ اشرشیا کلی بیماری زای روده ای (EPEC)………………………………………………………………………………………………………………20
1-7-4-4-پاتوتیپ اشرشیاکلی انترواگرگتیو(EAggEC)……………………………………………………………………………………………………………………………21
1-7-4-5-پاتوتیپ اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC)……………………………………………………………………………………………………………………….21
1-7-4-6-پاتوتیپاشرشیا کلی انترواینواسیو(EIEC)……………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1-8-عفونت های اشرشیا کلی های خارج روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………….22
1-8-1-1-باکتریولوژی و مننژیت اشرشیا کلی (MAEC)………………………………………………………………………………………………………………………….23
1-8-1-2-سپسیس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23
1-8-1-3-التهاب مثانه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23
1-8-1-4-سپتی سمی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24
1-8-2-عفونت مجاریادراری(UTI)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….24
1-8-2-1-مقاومت های آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..25
1-8-2-2-مقاومت در اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26
1-8-2-3-فیلوژنتیک اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..26
1-9-عوامل بیماری زایی(ویرولانس در اشرشیا)……………………………………………………………………………………………………………………………………………27
1-9-1-ژن aer (آئروباکتین)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28
1-9-1-2-اتصال دهنده ها (Adhesions)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….29
1-9-1-3-مکانیسم بیماری زاییUPEC در ارتباط با افمبریال ادهسین………………………………………………………………………………………………….30
1-9-1-5-مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با همولیزین (HlyA)……………………………………………………………………………………………..33
1-10-تعاریف واژه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..34
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- بررسی تحقیقات انجام شده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-نوع مطالعه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
3-2-جامعه مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………38
3-3-روش انجام طرح………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
3-3-1-مواد وتجهیزات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
عنوان صفحه3-3-1-1-دستگاه ها و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
3-3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41
3-3-1-3-محیط های کشت مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41
3-4-ترکیبات و محلول های مورد استفاده در تحقیق و فرمول ساخت آنها……………………………………………………………………………………………..41
3-5-روش اجرا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
3-5-1-جمع آوری اطلاعات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..43
3-5-2-انجام امور باکتریولوژیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43
3-5-3-نمونه برداری، کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتری ها……………………………………………………………………………………………………………43
3-5-3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43
3-5-3-2-طرز تهییه محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
3-5-3-3-نگه داری نمونه های عفونت ادراری………………………………………………………………………………………………………………………………………………45
3-5-3-4-نگه داری سویه باکتری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
3-5-4-استخراج، تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………………….46
3-5-4-1-استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..46
3-5-4-2-کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………..46
3-5-5-انجام آزمایشات مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47
3-5-5-1-پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47
3-5-5-2-رقیق سازی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….49
3-5-6-انجام PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49
3-5-6-1-بهینه سازی اجزاء واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..50
3-5-6-2-بهینه سازی تهیه Master Mix ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
3-5-7-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………50
3-5-7-1-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن HlyA…………………………………………………………………………………..51
3-5-7-2- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Pap ……………………………………………………………………………………..51
3-5-7-3- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Cnf ………………………………………………………………………………… 52
3-5-7-4- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Afa ………………………………………………………………………………….. 53
3-5-7-5-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژنFim ………………………………………………………………………………… 53
3-6-مراحل انجام PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-6-1-بهینه سازی PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-6-2-بررسی محصول PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
3-7-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56
3-7-1-ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
عنوان صفحه3-7-1-1-طرز تهییه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….56
3-7-1-3-بافر سنگین کننده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
3-7-1-4-رنگ آمیزی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57
3-8-توالی یابی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………57
3-9-1-روش گردآوری اطلاعات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57
3-9-2-روش تجزیه و تحلیل اطلاعات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….58
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1-فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59
4-2-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………..60
4-3-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن آئروباکتین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………………………………………………..61
4-3-1-بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….61
4-3-1-1-انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….62
4-3-2-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن سایتوتوکسیک نکروز دهنده در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………..64
4-3-2-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64
4-3-2-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64
4-3-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن همولیزین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………..65
4-3-3-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..65
4-4-4- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنP – فیمبریه در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………66
4-4-4-1- بهینه سازی دمای اتصال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66
4-4-4-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67
4-5-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Afaدر سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………..68
4-5-5-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..68
4-5-5-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..69
4-6-6- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنFim در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………70
4-6-6-1- بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70
4-7-ژن های ویرولانس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72
4-8-نتایج ویرولوتایپینگ سویه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
4-9-نتایج تایید محصولات PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………79
فصل پنجم: نتیجه گیری
5-1-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….91
5-2-مقایسه نتایج بدست آمده با یافته های دیگر محققین…………………………………………………………………………………………………………………………..91
عنوان صفحه5-3-نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….95
5-4- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..95
فهرست منابع
منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96
منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………97
چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..102زمون آ
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحهجدول 1-1: ژن های ویرولانس در اشرشیا کلی و عملکرد ژن ها………………………………………………………………………………………………………………….30
جدول3-1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48
جدول 3-2: اجزاء و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………..49
جدول 3-3: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
جدول 3-4: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن HlyA………………………………………………………………………………………………………………………………………51
جدول 3-5: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Pap ………………………………………………………………………………………………………………………………. 52
جدول 3-6: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Cnf ……………………………………………………………………………………………………………………………………..52 جدول 3-7: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Afa …………………………………………………………………………………………………………………………………………53
جدول 3-8: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………………………………………..54
جدول 4-1: مشخصات ایزوله های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران……………………………………………………………………………………………………………73
جدول 4-2: نتایج ویرولوتایپینگ درکل سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
جدول4-3: نتایج ویرولوتایپینگ در سویه های اشرشیا کلی، سویه های مشابه در هر ژن……………………………………………………………………….78

فهرست علامت ها و اختصارها
معادل فارسی معادل انگلیسی علامت
اشرشیا کلی Escherichia coli E.coli
واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR Polymerase chain reaction
عفونت مجاری ادراری Infectios UTI Urinary Tract
اشرشیا کلی یوروپاتوژن UPEC Uropathogenic Escherichia coli
فهرست شکل ها و تصویر ها
عنوان شکل صفحهشکل1-1: شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………..10
شکل1-2: شکل شماتیک از نحوه اتصال باکتریE.coli به سطح سلول های اپیتلیال سطحی بدن………………………………………………………..31
شکل1-3: شکل شماتیک از فاکتورهای ویرولانس در اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………..33
شکل1-4: شکل شماتیک از مکانیسم بیماری زاییUPEC ……………………………………………………………………………………………………………………………….34
شکل 3-1: کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….47
شکل 4-1: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن aer……………………………………………………………………………………………………………62
شکل4-1-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………….63
شکل4-1-2: نتایج PCR ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………63
شکل4-2: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Cnf ………………………………………………………………………………………………………….64
شکل4-2-1: نتایج PCR ژن Cnf در سایر ایزوله ها………………………………………………………………………………………………………………………………………….65
شکل4-3: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن HlyA ……………………………………………………………………………………………………..66
شکل4-4: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژنPap……………………………………………………………………………………………………………67
شکل4-4-1: نتایج PCR ژن Pap در سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………68
شکل 4-5: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Afa ……………………………………………………………………………………………………..69
شکل 4-5-1: نتایج PCR ژن Afa در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..70
شکل4-6: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………..71
شکل4-7: ژن های ویرولانس در کنار هم. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72
شکل4-8-1: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس aer…………………………………………………………………………..79
شکل4-8-2: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس HlyA……………………………………………………………………..81
عنوان شکل صفحهشکل4-8-3: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Cnf…………………………………………………………………………83
شکل4-8-4: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Afa …………………………………………………………………………86
شکل4-8-5: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Fim…………………………………………………………………………..88
شکل4-8-6: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانسPap…………………………………………………………………………….89

فهرست نمودار ها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1: فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59
نمودار4-2: فراوانی بیماران براساس سن (سال)…………………………………………………………………………………………………………………………………………..60
نمودار4-3: نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………….61

چکیده
زمینه و هدف: اشرشیا کلی یوروپاتوژن یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده عفونت مجاری ادراری است. این سویه ها انواع مختلفی از فاکتورهای ویرولانس از جمله چسبنده ها، توکسین ها، سیستم های اکتساب آهن را دارا می باشند. ژن های ویرولانس روی عناصر ژنتیکی متحرک و یا در نواحی خاصی از کروموزوم که جزایر پاتوژنیستی نامیده می شوند قرار دارند. هدف از این مطالعه بررسی وجود و تعیین هویت فاکتور های پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله(عج) تهران می باشد. مواد و روش ها: از 150 نمونه ی ادرار جمع آوری شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران مجموعه ای از 100 ایزوله ی اشرشیا کلی بین تیرماه تا دی ماه 1393 جدا گردید. باکتری اشرشیا کلی با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و میکروب شناسی استاندارد شناسایی شد. استخراج ژنوم باکتری ها با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت و بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای ویرولانس با استفاده از روش PCR انجام گرفت. نتایج: PCR به طور موفقیت آمیزی برای تمامی 6 ژن مورد نظر بهینه سازی شد و توانست باندهای مورد نظررا نشان دهند. عفونت مجاری ادراری ایجاد شده با اشرشیا کلی 83 % برآورد گردید شیوع ژن های ویرولانس به ترتیب شامل:(98%)( bp 328) Pap(95%)(bp 602) aer ،(94%)( bp 559) Fim،(86%)( bp 693)cnf ،(63%)( bp 750)Afa ، (62%)( bp 1177)hlyA به طور موفقیت آمیزی تکثیر یافتند. بحث: مطالعه حاضر نشان داد که شیوع ژن های ویرولانس pap ،aer ، Fimدر میان سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران بالا می باشد و کمترین شیوع مربوط به ژن hlyA (همولیزین)می باشد.
کلمات کلیدی: اشرشیا کلی یوروپاتوژن، عفونت مجاری ادراری، ژن های ویرولانس، واکنش زنجیره ای پلیمراز
فصل اول
مقدمه
1-1-بیان مسئله
اشریشیا کلی(E.coli)1 یک باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که به طور شایع در روده جانوران خونگرم و برخی پرندگان وجود دارد. انتقال این باکتری از طریق مسیر مدفوعی- دهانی از یک فرد به فرد دیگر و یا از طریق آب و غذای آلوده می باشد. اشریشیا کلی به خوبی روی محیط های معمولی رشد کرده و یک باکتری کم نیاز است و در روی محیط های جدا کننده روده ای بیشتر سویه ها کلنی های تخمیر کننده لاکتوز را ایجاد می کنند (هاملین و همکاران،2007)2. اشرشیا کلی یکی از مهمترین دلایل ایجاد کننده عفونت های کلیه، مثانه، ریه و مننژ می باشند که به نوبه خود ممکن است منجر به سپسیس گردند و یکی از مهمترین عوامل تهدید کننده حیات انسان محسوب می شوند (چانج و همکاران، 2006 )3. عفونت مجاری ادراری(UTI)4 یکی از شایع ترین عفونت های باکتریایی در انسان است که به طور عمده توسط اشرشیا کلی ایجاد می شود(گریبلینگ و توماس، 2005)5. عفونت های ادراری از لحاظ شیوع، رتبه دوم را پس از عفونت های تنفسی داشته و در بزرگسالان رتبه اول بیماری های عفونی بزرگسالان را از نظر مراجعه به پزشک تشکیل می دهند. به این ترتیب اهمیت عفونت های ادراری از نظر عوارض بسیار جدی که در نتیجه عدم تشخیص درمان مناسب بر جای می گذارد بر کسی پوشیده نیست در ارزیابی تکامل ژنتیکی اشرشیا کلی، بررسی های فیلوژنتیکی از اهمیت خاصی برخوردار است. اشرشیا کلی عامل 90-80 درصد از عفونت مجاری ادراری اکتسابی از جامعه و 50-30 درصد از عفونت مجاری ادراری بیمارستانی است(نعمتی و همکاران، 2014).
1
2 عفونت مجاری ادراری از علل عمده بستری شدن در بیمارستان با عوارض قابل توجه و هزینه های مراقبت بهداشتی است(نعمتی و همکاران، 2014 ). تشخیص و درمان موثر عفونت مجاری ادراری یک نگرانی بزرگ در زمینه ی مراقبت های بهداشتی است(سنتیلو و فرانکلین، 2007)1. در سراسر جهان حدود 150 میلیون نفر با عفونت مجاری ادراری تشخیص داده شده اند که هر ساله هزینه اقتصادی در این زمینه بیش از 6 میلیارد دلار در جهان می باشد (کومار و همکاران، 2006)2. شدت عفونت مجاری ادراری به دو عامل ویرولانس باکتری و حساسیت میزبان بستگی دارد(گریبلینگ و توماس، 2005). اشرشیا کلی ایجاد کننده ی عفونت مجاری ادراری UPEC))3 فاکتورهای ویرولانس مختلفی از جمله آلفا همولیزین، فاکتور نکروز دهنده سایتوتوکسیک، چسبنده ها و سیستم های اکتساب آهن دارد; این فاکتورها در نهایت منجر به آسیب بافتی می شوند(پیت آئوت، 2012)4. اتصال باکتری به سلول های اورو اپی تلیال یک مرحله ضروری برای شروع و گسترش است. این فرایند به باکتری اجازه می دهند تا در مقابل عملکرد شستشوی ادرار و تخلیه مثانه و فعال شدن مسیرهای انتقال پیام در میزبان مقاومت کند. سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن قادر هستند تا انواع متفاوتی از چسبنده های لازم برای تشخیص و اتصال به رسپتورهای مجاری ادراری را تولید کنند: از جمله فیمبریه تیپ 1 که توسط ژن fim کد می شود، P فیمبریه که توسط ژن های pap (phylonephritis-associated pili) کد می شود، S فیمبریه که توسط ژن های sfa کد می شود و چسبنده ی Afa که توسط ژن های afa کد می شود(آنتااو و همکاران، 2009)5. تولید توکسین ها مانند همولیزین و سایتوتوکسیک نکروز دهنده فاکتور 1(CNF1 ( باعث آسیب بافتی می شود که انتشار باکتری و ترشح مواد غذایی میزبان را تسهیل می کنند و ممکن است همچنین باعث تغییر مسیرهای انتقال پیام در میزبان شود(توماس و همکاران، 2011)6. از دیگر خصوصیات UPEC برای ایجاد عفونت مجاری ادراری سیستم اکتساب آهن است که باکتری با کمک سیدروفورها آهن را از محیط جذب می کند. ژن aer سیدروفور آئروباکتین را کد می کند (نعمتی و همکاران، 2014).
1-2- اهمیت و ضرورت تحقیق
تحقیق فوق از آن جهت حائز اهمیت نو آوری است که تاکنون در خصوص شناسایی ژن های پاتوژنیسته و ویرولوتیینگ ایزوله های جداشده از منابع یوروپاتوژن عفونت های ادراری اشرشیا کلی تحقیقی جامع در برخی بیمارستان ها از جمله بیمارستان بقیه الله (عج) تهران انجام نشده است و ما قصد داریم این تحقیق را برای اولین بار در این بیمارستان به انجام برسانیم.

1-3-اهداف تحقیق:

➢ اهداف علمی:
1. تعیین فراوانی ژن های مرتبط با بیماری زایی سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جداشده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله(عج) تهران.
2. تعیین ویرولوتیپ های سویه های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران بیمارستان بقیه الله (عج) تهران.
3. تعیین رابطه ی بین ژن های پاتوژنیسته خاص با سویه های جدا شده از اشرشیا کلی یوروپاتوژن از بیماران بیمارستان بقیه الله (عج) تهران.
➢ اهداف کاربردی:
راه اندازی روش های سریع شناسایی ژن های پاتوژنیسته و تعیین ویرولوتیپ های سویه ها
1-4- فرضیه های تحقیق:
1. سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از عفونت های ادراری دارای ژن های ویرولانس خاصی می باشند.
2. انتظار می رود فراوانی ژن های ویرولانس باکتری اشرشیا کلی در ایران همانند کشورهای دیگر باشد.
3. بین حضور ژن های خاص ویرولانس و منبع جداسازی باکتری ها رابطه وجود دارد.
1-5- تاریخچه
اشرشیا کلی اولین بار به وسیله پزشکی آلمانی به نام تئودر اشریش1شناسایی شد. او در سال 1885، این ارگانیسم را باکتریوم کلی 2 نامید و آن را به عنوان عامل بیماری زای اصلی عفونت های روده ای و برخی از عفونت های خارج روده ای معرفی کرد. نام باکتریوم کلی به طور وسیع تا سال 1919 استفاده می شد تا وقتی که کاستلائی 3 و کالمرز4جنس اشرشیا را تعریف کردند و نام اشرشیا کلی را پایه نهادند. 3
اشرشیا کلی4ارگانیسمی است که به شدت از جنبه های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. در باکتریولوژی عمومی به عنوان ارگانیسم مدل برای مطالعه ی ساختار سلولی، رشد ومتابولیسم استفاده می شود، همچنین ابزاری بسیار مهم برای کلونینگ ژن ها در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی و بیان محصولات ژن ها شده است. اشرشیا کلی به عنوان ارگانیسم کنترلی جهت انجام آزمایشهای کنترلی موثر بودن عوامل ضد میکروبی و مواد ضد عفونی کننده استفاده می شود و به عنوان ارگانیسم اندیکاتور جهت تعیین آلودگی مدفوعی، مواد غذایی، آب و محیط مطرح می باشد و نقش مهمی را به عنوان فلور میکروبی روده ی انسان و حیوانات خونگرم تشکیل می دهد. کم و بیش برخی از سویه های پاتوژن های مهمی برای میزبان هایشان هستند.

1-5-1- خانواده انتروباکتریاسه
خانواده انتروباکتریاسه بزرگترین و ناهمگون ترین مجموعه ی باسیل های گرم منفی هستند که از لحاظ بالینی اهمیت دارند. حداقل 28 جنس و 7 گروه روده ای5 با بیش از 80 سویه شناخته شده است. جنس های این خانواده بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی، ساختار آنتی ژنی و ترادف یابی اسیدهای نوکلئیک طبقه بندی شده اند. باکتری های متعلق به انتروباکتریاسه گسترش جهانی داشته و ساکن روده ی حیوانات و انسان ها هستند و گیاهان، خاک و آب را آلوده می سازند. آن ها بسیاری از بیماری های بالینی از قبیل آبسه، پنومونی6، مننزیت، سپتی سمی و عفونت های اداری را باعث می شوند(عموئیان و میبدی، 1383). باکتری های خانواده انتروباکتریاسه را به دو دسته باکتری های فرصت طلب و بیماری زای روده ای تقسیم می کنند که برخی از جنس های این خانواده مثل سالمونلا، شیگلا و یرسینا همیشه مرتبط با بیماری هستند و جز پاتوژن های روده ای می باشند ولی برخی دیگر مانند اشرشیا کلی، کلبسیلا و پروتئوس به عنوان فلور طبیعی روده بوده و با ایجاد شدن شرایطی مانند کسب ژن های بیماری زایی از طریق پلاسمید و باکتریوفاژ، به هم خوردگی فلور میکروبی، جابجایی فلور میکروبی و غیره، قدرت بیماری زایی را به دست آورده و سبب ایجاد عفونت های فرصت طلب می شوند.5
1-5-2- اشرشیا کلی
اشرشیا کلی شایع ترین و مهمترین جنس در خانواده انتروباکتریاسه می باشد که در پزشکی اهمیت دارد. اشرشیا کلی باکتری بی هوازی اختیاری و بخشی از فلور فیزیولوژی روده ای در انسان و حیوانات خونگرم است اما برخی از سویه ها سبب بیماری هایی مثل پنومونی، گاستروانتریت1، بیماری های ادراری –تناسلی و سپتی سمی می شوند. چندین واریانت پاتوژن اجباری و اختیاری از اشرشیا کلی وجود دارد که باعث انواع مختلفی از عفونت های روده ای و خارج روده ای در انسان و حیوانات می شود. در سال های اخیر سویه O157:H7 اشرشیا کلی به عنوان پاتوژن مهم مشترک بین انسان و دام مطرح گردیده، که از طریق غذا منتقل می شود. این سویه عامل سندرم اورمی همولیتیک –کولیت خونریزی دهنده 2 در انسان است (عادلی، 1386).

1-5-3- طبقه بندی
برای اولین بار دسته بندی اشرشیا کلی بر اساس تیپ های متنوعی از آنتی ژن سوماتیک O توسط کائوفمن3 انجام گرفت. برخی محققین چندین گونه برای آن قائل اند : اشرشیا هرمانی4، اشرشیا دکربوکسیلاتا5، اشرشیا ولنزی6، اشرشیا فرگوسنی7، اشرشیا کلی و اشرشیا بلاته8، که بین این ها گونه اخیر از موارد انسانی جدا نشده است. در کتاب Bergeys Manual که در سال 1984 چاپ شد، بر اساس یافته های DNA در خانواده انتروباکتریاسه 20 جنس قرار گرفت (رحیمی، 1387 ).6
• طبقه بندی اشرشیا کلی بر دو اساس صورت می گیرد:
1. بر اساس ساختار آنتی ژنی
2. بر اساس Colicin typing (شناسایی کلی سین ها)
1-5-3-1- ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی
آنتی ژن های سطحی در اشرشیا کلی را می توان به وسیله آزمایش هماگلوتیناسیون نشان داد: سه نوع آنتی ژن سطحی بطور گسترده برای تعیین سروتیپ ارگانیسم های انتریک استفاده می شوند که شامل آنتی ژن های سوماتیک 1 (آنتی ژن (O، آنتی ژن کپسولی ( آنتی ژن K ) و آنتی ژن تاژکی ( آنتی ژن H ) می باشند(تصویر شماره1-1). آنتی ژنF یا فیمبریه ای، نیز جزء آنتی ژن های سطحی است که در برخی از سروتیپ ها یافت می شود.

1-5-3-2- ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O
آنتی ژن سطحی O، بخشی از لیپو پلی ساکارید 2 یا LPS جدار باکتری است. LPS، مجتمع گلیکولیپیدی جدار باکتری های گرم منفی است و از سه ساختار مشخص تشکیل شده است :
الف- هسته مرکزی پلی ساکاریدی، که یک قند 8 کربنی به نام کتودزاکسی اوکتونات است و به آنتی ژن اختصاصیO متصل می شود.
ب- لیپید A که به هسته مرکزی متصل می شود و بروز تاثیرات بیولوژیکLPS باکتری های گرم منفی ناشی از این بخش از باکتری است و درواقع اندوتوکسین باکتری محسوب می شود. لیپید A می تواند باعث تب، لوکوپنی و حتی نهایتاً مرگ شود.
ج – آنتی ژن اختصاصی O، که پلیمری از واحد های تکراری الیگوساکاریدی است و به خاطر تفاوت آن در سویه های مختلف، در تعیین سروتیپ حائز اهمیت است.
به نظر می رسد طول زنجیره جانبی اختصاصی Oو انتشار آن در سطح باکتری در مقاومت نسبت به کمپلمان نقش داشته باشد، یعنی سویه هایی که بیش از 20 درصد از زنجیره های مولکولی LPS آن ها طویل هستند نسبت به تاثیر سرم مقاومند، در حالی که سویه هایی که کمتر از 20 درصد زنجیره های مولکولی LPS آن ها طویل باشد، نسبت به سرم حساس هستند. بر همین اساس، اخیراً آنتی بیوتیک هایی طراحی شده است که با بیوسنتز پلی ساکارید مرکزی LPS تداخل می کنند.7
همچنین بیان شده که در بین باکتری های روده ای، اجرامی که آنتی ژن های سوماتیک آن ها دارای گروه های فوق العاده هیدروفوبیک 3 ( قندهای دی دزاکسی ) باشند، بیماری زا تر هستند. آنتی ژن های O مقاوم به حرارت هستند و در دمای 100 درجه سانتی گراد برای 5/2 ساعت هم غیر فعال نمی شوند (کویین و همکاران، 1386)4.
آنتی ژن O در تنوع آنتی ژنی شرکت دارد و باعث القاء پاسخ های سیستم ایمنی میزبان می شود. غربالگری سروگروه های سوماتیک اشرشیا کلی یک روش متداول در شناسایی اشرشیا کلی است. به طوری که براساس آنتی ژن O اشرشیا کلی 14 سروتیپ را ایجاد می کند که شامل O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16,O18, O21, O22, O25, O75, O85 می باشند. آنتی ژن سوماتیک به عنوان آنتی ژن اختصاصی در هر جنس مطرح می باشد، اما واکنش متقاطع بین جنس های بسیار نزدیک (سالمونلا با سیتروباکتر1 و اشرشیاکلی با شیگلا) شایع می باشد (موری، 1389; بران و همکاران، 2002)2.
1-5-3-3- ساختار آنتی ژن کپسولی یا آنتی ژن k
این آنتی ژن در اکثر جنس های خانواده انتروباکتریاسه به صورت یک لایه چسبنده همگن اطراف باکتری را فرا گرفته و روی آنتی ژن O قرار دارد و نسبت به حرارت حساس است و به طور معمول برای تیپ بندی سویه ها استفاده نمی شود، اما از این جهت اهمیت دارد که ممکن است در تشخیص آنتی ژن O اختلال ایجاد کند پادگن کپسولی k که گاهی به آن پادگن پوششی هم می گویند، روی پادگن های O قرار گرفته و مانع آگلوتیناسیون 3 آن با آنتی سرمO 4 می شوند. با جوشاندن سوسپانسیون ارگانیسم به منظور از بین بردن آنتی ژن K (که حساس به حرارت است ) و باقی ماندن آنتی ژن O (مقاوم به حرارت ) در حرارت زیاد می توان بر این مشکل فایق آمد(کویا، 1998). ماهیت این گروه پادگنی پلی ساکاریدی بوده که با حرارت دادن، تغییر یافته و در نتیجه آگلوتیناسیون بین آنها رخ می دهد. در طی تحقیقات اخیر مشخص شده است که پادگن های K در سویه های خاصی از اشرشیا کلی ماهیت پروتئینی دارد. فیمبریه های K99 و K88 جدا شده از حیوانات و پادگن های عوامل سیطره ای جدا شده از انسان، مثال هایی از پادگن های K غیر پلی ساکاریدی هستند. در مجموع تعداد کمی از سویه های اشرشیا کلی دارای کپسول می باشند. پادگن های A, B, L در بیرون از جدار یاخته و پادگن O وجود دارند. در این میان باکتری های واجد پادگن نوع A کپسول دار هستند.8
و باکتری های واجد پادگن های نوع Lو B تنها در محیط قنددار و در دمای 20-15 درجه سانتی گراد می توانند کپسول تولید کنند. هم اکنون حدود 180 آنتی ژن متفاوت K برای اشرشیا کلی شناسایی شده است (کوبین و همکاران، 1386; کبیر، 2010).

1-5-3-4- ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H
آنتی ژن های تاژکی، پروتئین های حساس به حرارت هستند و به وسیله ی آگلوتیناسیون اسلایدی یا لوله ای با استفاده از محیط مایع یا رشد روی محیط نیمه جامد برای فعالیت سویه های بسیار متحرک مشخص می شوند. بیشتر آنتی ژن های H مختص گونه هستند و تنها در تعداد کمی ذره های مهم آنتی ژنی وجود دارند و ممکن است در باکتری وجود نداشته باشند یا دچار تغییرات آنتی ژنتیکی شوند. بیشتر این آنتی ژن ها مونوفاژیک هستند اما ندرتاً سویه های دی فازیک نیز گزارش شده است. گاهی تحرک در دمای 30 درجه سانتی گراد بهتر از 37 درجه رخ می دهد(موری، 1389; نوروزی، 1389).

1-5-3-5- ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F
برای مرحله ی اتصال و چسبندگی باکتری لازم هستند و جزء فاکتورهای مهم ویرولانس باکتری محسوب می شوند. معمولاً در دمای 37 درجه بیان می شوند و در دمای 18 درجه بیان نخواهند شد. آنتی ژن F پروتئین های حساس به حرارت هستند. توانایی آگلوتیناسیون گلبول های قرمز مختلف، برای توصیف ویژگی های سویه های فیمبریه دار استفاده می شود. توانایی هماگلوتیناسیون بیشتر سویه های اشرشیا کلی در حضور مانوز (هماگلوتیناسیون حساس به مانوز )کاهش می یابد مانند فیمبریه تیپ 1 علاوه براین سویه هایی که منجر به اسهال یا بیماری های خارج روده ای می شوند ممکن است فیمبریه هایی را تولید کنند که قادر به هماگلوتیناسیون در حضور قند مانوز ( هماگلوتیناسیون مقاوم به مانوز ) هستند این آنتی ژن ها به وسیله ژن های پلاسمیدی کد می شوند. از آن جایی که آنتی ژن F در سروتایپینگ باعث ایجاد واکنش متقاطع می شود بایستی از عدم حضور آن مطمئن شد. به همین دلیل یا از کشت هایی استفاده می شود که باکتری در فاز غیر فیمبریه ای 1 باشد و یا باکتری به مدت یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود تا فیمبریه ای از بین برود(تچسنوکوا و همکاران، 2013)2.9
تصویر شماره(1-1): شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی
1-5-3-6- رده بندی بر اساس نوع کلی سین :
کلی سین ها ترکیباتی پروتئینی می باشند که همانند آنتی بیوتیک ها عمل کرده و تنها روی سویه ها ی همان گونه موثر می باشد و تولید آنها به وسیله پلاسمید کنترل می گردد. کلی سین نوعی باکتریوسین است سویه های مولد باکتریوسین ها نسبت به باکتریوسین های خود مقاوم اند بنابراین از کلی سین ها نیز می توان برای طبقه بندی اشرشیا کلی استفاده کرد.
1-6- خصوصیات مورفولوژی
اشرشیا کلی سلول های میله ای شکل با 4-2 میکرومتر طول و 5/1- 1/1 میکرومتر عرض هستند که انتهای گرد دارند و به صورت منفرد، زنجیره دوتایی و یا چند تایی قرار می گیرد. جدار سلولی این باکتری ها شامل مورئین لیپوپروتئین 1، فسفولیپید 2 و لیپوپلی ساکارید است که در واقع ساختمان جدار باکتری های گرم منفی است. لیپوپلی ساکارید دارای زنجیر اختصاصی پلی ساکاریدی است که عهده دار بروز خصوصیات پادتنی در گونه های مختلف است(کیسر و همکاران، 2005)3.10.
اسپور تشکیل نمی دهند، بعضی نیز زمانی که در محیط واجد قند و در دمای 20-15 درجه سانتی گراد کشت داده شوند لایه لعابی 1در اطراف خود ایجاد می کنند. حدود 80 درصد سویه های باکتری متحرکند که این امر بواسطه وجود تاژک های اطرافی 2 امکان پذیر می گردد، کپسول یا میکروکپسول های ساخته شده از پلی ساکارید های اسیدی تولید می کنند اشرشیا کلی انواع متفاوتی از پیلی را تولید می کند که از نظر ساختمانی و خصوصیات آنتی ژنی متفاوت هستند و رشته های پروتئینی مو شکلی هستند که دورتادور باکتری را احاطه کرده اند. تقریباً 80 درصد سویه های دارای فیمبریه، که اغلب از نوع فیمبریه تیپ یک است، می باشند که توان هماگلوتیناسیون و اتصال به سلول های اپیتلیال را



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید