واحد علوم و تحقیقات
پایان نامه کارشناسی ارشد زیست شناسی (M.Sc)
موضوع
بهینه سازی فرآیند تولید پروتئینهای نوترکیب در
سیستم بیان موقت TGE (Transient Gene Expression) از دیدگاه Scale –Up در بیوپروسه
استاد راهنما
دکتر فاطمه دوامی
استاد مشاور
دکتر یگانه طالب خان گروسی
نگارنده
فرناز اقبال پور
سال تحصیلی 92-1391
عنوان
چکیده9
مقدمه10
1-1)اهمیت پروتئینهای نوترکیب -جایگاه جهانی و درمانی10
1-2)بیماری های قلبی عروقی12
1-3)پاتوفیزیولوژی ترومبوآمبولی12
1-3-1)سکته مغزی12
1-3-2)ترومبوآمبولی عروق عمقی اندام ها12
1-4) مسیر انعقاد13
1-5) فیبرینولیز14
1-6) درمان16
1-7) داروهای ترومبولیتیک17
1-8)جنبه های اقتصادی18
1-9) تاریخچه داروهای ترومبولیتیک18
1-10)روش های مقابله با ترومبوآمبولی19
1-11)تجزیه لخته های فیبرینی20
1-12)مهار کننده های t-PA20
1-12-1) 2 α آنتی پلاسمین21
1-12-2) 2 α ماکروگلوبین21
1-12-3) TAF-I)) Thrombin Activable Fibrinogen Inhibitor21
1-13)سنتز t-PA22
1-14)میل الحاقی به فیبرین22
1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر22
1-16)ساختار دومن ها23
1-17)تاریخچه درمان تجزیه لخته24
1-18)داروهای تجزیه کننده فیبرین24
1-19)طبقه‌بندي داروهاي ترومبوليتيک24
1-20)انواع فعال کننده های پلاسمینوژن25
1-20-1) Streptokinase27
1-20-2) Urokinase27
1-20-3) Staphylokinase28
1-20-4) Alteplase28
1-20-5) Reteplase29
1-20-6) Tenecteplase30
1-20-7) Lanoteplase30
1-21) Truncated t-PA30
1-20-8) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب32
1-21)انتخاب رده سلولی مناسب33
1-22)رده های سلولی رایج در بیان پروتئین های نوترکیب34
1-23)مزایای CHO34
1-24)روش های بیان ژن34
1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression))34
1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression))34
1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران36
1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی36
1-26)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب37
1-27)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت37
1-27-1)سلول های غیر وابسته به بستر37
1-27-2)سلول‌های وابسته به بستر38
1-28) کشت معلق38
1-29)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت39
1-30)بهینه سازی شرایط کشت سلول39
1-31)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی39
1-31-1)نقش گلوکز در محیط کشت40
1-32)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت41
1-32-1)عناصر ماکرو42
1-32-2)عناصر میکرو42
1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت42
1-32-4)ویتامین ها 43
1-32-5) Pluronic acid43
1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت44
مواد و روش ها46
2-1)دستگاه های مورد نیاز47
2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده47
2-3)لیست کامل مواد استفاده شده48
2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده50
2-5) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG4450
2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی51
2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC51
2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت51
2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG4452
2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG4452
2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG4453
2-8-1)انكوباتور دي اكسيد كربن53
2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG4453
2-8-3) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG4454
2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG4454
2-9) استریلیزاسیون انکوباتور54
2-10) آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها55
2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک55
2-11) کشت سلول های rCHO DG4456
2-12)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH56
2-13) شمارش سلول های rCHO DG4457
2-13-1)اصول شمارش سلول57
2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability))59
2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها Cell Freezing))59
2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG4460
2-14-1)پلاسمید حاوی ژن60
2-14-2)تهیه DNA‌60
2-14-3)کشت سلول61
2-15)بهینه سازی فرایند TGE61
2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI61
2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE61
2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE62
2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن62
2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری62
2-16)افزودن غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت62
2-16-1) تعیین پروفایل رشد70
2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش Elisa70
2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها72
نتایج76
3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE76
3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE76
3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE83
3-1-3)بررسی میزان بهینه DNAجهت انجام TGE96
3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC109
3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت110
3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA115
3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5115
3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44117
3-4-3) بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD118
3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب119
3-6)بررسی تاثیر استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE121
بحث و نتیجه گیری نهایی129
منابع133
اختصارات136
Optimization of recombinant protein production in TGE system137
Abstract137
چکیده
بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.
فعال‌کننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، يک پپتيد طبيعي است که با اتصال به فيبرين موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فيبرين، فيبرينوژن و ساير پروتئين‌هاي انعقادي شده و با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسيب بافتي و در نهايت نجات بيمار مي‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.
بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell DNA106/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell 106/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده 105×5 سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA)در سلول CHO در این فرایند از 6 پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.
واژه های کلیدی: سلول CHO , t-PA , فیبرینولیز ,فیبرینوژن
مقدمه
1-1)اهمیت پروئینهای نوترکیب – جایگاه جهانی و درمانی
پروتئین ها ماکرومولکولهایی هستند که در هرجایی از سلولها جای می گیرند.آنها در رشد سلولی، متابولیسم، سازماندهی، انتقال و جهش نقش دارند. در ارگانیسم های چندسلولی، پروتئین ها سیستم ایمنی، سیگنال بندی عصب، رشد و تقسیم کل ارگانیسم را کنترل می کنند.جهش یا رونویسی غیرعادی پروتئین ها می تواند منشاء بیماریهای بسیاری شود. با توجه به اینکه ژنوم انسان حاوی بیش از 30.000 ژن است و اینکه تعداد پروتئین هایی که تولید می شوند حتی بیشتر از این مقدار هستند،فرصت هایی برای شرکت های داروسازی به دست آمده تا داروهای جدیدی را توسعه دهند که بسیار فراوان هستند. بنابراین در طول دهه های گذشته،پروتئین ها به اهدافی برای توسعه درمانهای جدید تبدیل شدند. وقتی که پروتئین ها اولین بار به عنوان موارد درمانی مورد استفاده قرار گرفتند، از منابع انسانی و حیوانی خالص سازی شدند. نمونه هایی از این قبیل شامل هورمون رشد انسان از جسد انسان، انسولین از گاو یا خوک و هورمون تحریک کننده غدد ترشحی انسان از اوره می شدند. به هر حال استفاده از این منابع با نگرانی هایی هم همراه بود.خوشبختانه امروزه محصولات منابع حیوانی کمتر به کار می روند. در واقع از اواخر دهه 1970، رشد در بیوتکنولوژی امکان تولید پروتئین از “DNA دارای صفات ارثی” با استفاده از سیستم های میزبان پروکاریوتی یا یوکاریوتی را فراهم کرده است.این پروتئین ها ، دارای صفات ارثی هستند و از پروتئین های داخلی قابل تمایز هستند، آنها بواسطه رونویسی ژنهایی که دارای صفات ارثی جدید هستند، تولید می شوند. اولین پروتئین نوترکیب، که برای انسان به کار رفت انسولین بود که در E.coli توسط Eli Lili در سال 1984 تولید شد. اولین پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان یوکاریوتی ، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی t-PA از سلولهای تخمدان هامستر چینی CHO2 بود که در سال 1986 تولید شد. در سال 2007، بیش از 170 محصول بیودارویی وجود داشت که توسط انجمن دارو و غذا FDA در ایالات متحده تائید شد، اما انتظار می رفت که در سالهای آتی این مقدار افزایش یابد، در سال 2006، حدود 5.000 محصول پروتئینی در آزمایشات اکتشافی و بالینی و پیش بالینی گزارش شد.در میان سیستم های رونویسی کننده میزبان، آنچه که بسیار کاربرد داشت سلولهای کشت شده پستانداران و E.coli بود. حدود نیمی از محصولات پروتئینی درمانی در بازار از سلولهای پستانداران تولید می شد. حتی اگر بافت سلول پستانداران پیچیده و پرهزینه تری نسبت به کشت میکروبی بود باز این سلولها ارجحیت داشتند زیرا سلولهای پستانداران قادر به اصلاح پروتئین ها بعد از PTM (Post Translational Modification) ، و بخصوص گلیکوزیلاسیون بودند.میزبانهای دیگر قادر گلیکوزیلدار کردن پروتئین ها بودند مثل مخمر و سلولهای گیاهان و حشرات کشت شده. این فرایند در این میزبان ها نسبت به آنچه که در سلولهای پستانداران دیده شد، متفاوت بود.اما تلاشها همچنان ادامه داشت تا گلیکوزیلاسیون در این میزبانهای غیر پستاندار هم به شکل پستانداران هدایت شود. در سال 2007، FDA اولین بیودارویی که در سلولهای حشرات برای کاربریهای انسانی تولید شده بود، تائید کرد.میزبانهای جایگزین شامل حیوانات و گیاهان ترنس ژنیک می شدند اما اینها هنوز در مرحله توسعه قرار داشتند.
در سال 1973 Staley Cohenو Herbert Boyer به عنوان پیشگام در استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای کلونینگ و بیان ژن خارجی در موجودات شناخته شدند.
تولید اولین پروتئین نوترکیب انسانی چند سال بعد از، زمانی که شرکت زیست فناوری Genetchبیان ژن سوماتوستاتین انسانی را در E. coli را اعلام کرد گزارش شد. میزان فعالیت هورمون به دست امده معادل استخراج سوماتوستاتین از مغز 500.000 راس گوسفند بود. به دنبال این موفقیت در سال 1982 Genetch با humulin ، که انسولین نوترکیب به دست امده از E.coli بود را به عنوان اولین نوترکیب داروی زیست فناوری پذیرفته شده توسط غذا و داروی آمریکا (FDA) را به بازار عرضه کرد.
آنها DNA پلاسمید RSF1010 استرپتومایسین مقاومت از سالمونلا تیفی موریوم را به پلاسمید به pSC101 اشرشیاکلی را کلون نمودند و وجود مقاومت به استرپتومایسین در سلولهای ترانسفورم شده را مشاهده کردند.
ساخت پروتئین نوترکیب یک مرحله چالش برانگیز درفرآیند کشف و تولید دارو می باشد.
نهادهای توسعه یافته از صنعت بیوتکنولوژی دارویی عمدتا بر مبنای تولید آنتی بادی مونوکلونال (mAbs) و قطعات آن هستند.
امروزه نیاز به پروتئینهای نوترکیب در تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی رشد روز افزونی از خود نشان می دهد.
طی سال های اخیر تکنیکهای بیوتکنولوژی با ایجاد تحول درزمینه بهداشت ومواد غذایی رویکرد جهانی به این علم را افزایش داده است و محصولات نوترکیب که با روش های مهندسی ژنتیک و دستورزی ژنی و DNA نوترکیب در موجودات مختلف تولید شده تحول عظیمی در نوع و تنوع فراورده های دارویی به وجود آورده است.
داروها و واکسن هایی که از طریق بیوتکنولوژی ساخته شده اند سالانه به میلیون ها انسان که از بیماری های قلبی, سرطان, دیابت, پارکینسون, آلزایمر و … رنج می برند کمک می کند. و امروزه فراورده های نوترکیب دارویی با وزن مولکولی بالا جایگزین مولکول کوچک شیمیایی شده اند. امروزه تولید پروتئین های نوترکیب به یک صنعت بزرگ جهانی با حجم سالانه بیش از 50 میلیارد دلار تبدیل شده است. و میزان رشد سالیانه آن 20% تخمین زده می شود.
در بخش صنعتی سلول CHO در تولید فاکتورهای انعقادی 7و 8و9 , کلسی تونین, DNAse بیماری سیستیک فیبروزیس, اریتروپویتین ,FSH,LH,گنادوتروپین ,داربپویتین, فاکتور Stem cell , t-PA , اینترفرون بتا و فاکتور فعال کننده رشد پلاکتی(PDGF) کاربرد دارد.
1-2)بیماری های قلبی عروقی
بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد. طی پدیده آترواسکلروز مجرای عروق کرونر تنگ شده و خونرسانی به عضله قلب دچار اختلال می شود [2].
1-3)پاتوفیزیولوژی ترومبوآمبولی
به دنبال فعالیت ناخواسته سیستم انعقاد خون فیبرینوژن به فیبرین تبدیل شده که این امر سبب پلی مریزه شدن فیبرین همراه با تجمع پلاکتی و در نهایت موجب بروز ترومبوز می شود.این امر سبب عدم خونرسانی به بافت درگیر شده و اختلال ایجاد می نماید.
1-3-1)سکته مغزی
به دلیل ایجاد انسداد عروق مغزی در اثر ترومبوآمبولی ایجاد می گردد و عدم درمان آن می تواند سبب صدمات حبران ناپذیر حسی و حرکتی و حتی مرگ می شود [1].
1-3-2)ترومبوآمبولی عروق عمقی اندام ها
این بیماری باعث انسداد عروق و صدمات جدی در اندام درگیر می شود.
Myocardial infarction یا سکته قلبی به دلیل نرسیدن خون و اکسیژن کافی به یک منطقه از قلب ایجاد می گردد.بیشتر حملات قلبی به دلیل مسدود شدن یکی از رگهای کرونر که خون واکسیژن را به عضله قلب می رسانند ایجاد می شوند .لخته درون رگ کرونری جریان خون و اکسیژن رسانی به عضله قلب را مختل می کند که همین امر سبب مرگ سلولهای قلبی در ان ناحیه می شود. ماهیچه قلبی آسیب دیده توانایی خود را بر انقباض از دست می دهد. در نتیجه کمبود اکسیژن و مواد غذایی و انباشت مواد زائد در عضله قلب ، دردی پدید می آید که به درد قلبی یا آنژین صدری معروف است. اگر سرخرگ کرونر بطور کامل بسته شود ، سلولهای قلبی مربوط به آن حوزه خواهند مرد که به این وضعیت انفارکتوس یا سکته قلبی می گویند و گاهی نیز در اثر اختلال شدید و گسترده در کارکرد عضله قلب ،مرگ ناگهانی رخ می دهد.
سکته قلبی در اثر انسداد عروق مغزی و به دنبال ترومبوامبولی صدمات جبران ناپذیر حسی و حرکتی که گاهی منجربه مرگ می شود ایجاد می نماید.عروق کرونر تنگ شده و خونرسانی به عضله قلب دچار اختلال می شود[4].
آمبولی ریه بیشتر از اندام های تحتانی به ریه منتقل شده و در بسیاری از موارد به مرگ بیمار منجر می شود.
ترومبو آمبولی در عروق کلیه باانسداد عروق سبب نارسایی کلیه می شود.
همه این اختلالات نشان دهنده شیوع و بروز مرگ ومیر وسیع ناشی از ترومبوآمبولی می باشد که همین امر تولید داروهای موثر در درمان این عارضه را حائز اهمیت فراوان می نماید.
1-4) مسیر انعقاد
انعقاد صحیح و به موقع خون با ممانعت از اتلاف بیش از حد خون سبب بقای زندگی می شود. روند طبیعی انعقاد خون مستلزم وجود تعادل یا هموئستاز بین فاکتورهای پیش انعقادی و ضدانعقادی می باشد.
متعاقب تجمع پلاکت ها پس از آسیب عروق و منقبض شدن دیواره رگ ها واکنش های زنجیره ای انعقاد خون اغاز می شود.حداقل 13 فاکتور در تحقق انعقاد خون شرکت می کنند که با فعال شدن فاکتور 10یا 12 یا هر دو آغاز می شود.سپس ترومبین فعال شده وبا شکستن زنجیره آلفا و گاما در مولکول فیبرینوژن محلول در آب ,مونومرهای رشته ای نامحلول فیبرین ایجاد می نماید.با قرار گرفتن متقاطع رشته های فیبرین شبکه توری مانندی ایجاد می شود که سلولهای خونی به خصوص گلبولهای قرمز در آن به دام می افتند و لخته پدید می آید.
پلاکتها قادرند در حضور یون کلسیم پروترومبین را به ترومبین تبدیل نمایند و سبب افزایش مقدار ترومبین و شدت واکنش شوند.درنهایت بر هم کنشهای الکتروستاتیک بین مولکول های مونومر سبب ایجاد پلی مر فیبرینی محکم وتشکیل لخته می شود.فاکتور13 با ایجاد پیوندهای کووالانسی بین زنجیره های آلفا وگاما درمولکول فیبرین مسئول پایدار شدن نهایی لخته ایجاد شده می باشد.
پاکسازی خون از عوامل ایجاد کننده لخته توسط سلولهای فاگوسیت تک هسته ای, کبد , پروتئین C فعال شده و مسیر فیبرینولیز انجام می گیرد.
برای ایجاد تعادل در واکنش های انعقاد و جریان یافتن خون در رگها لازم است لخته ایجاد شده پس از مدتی لیز شود. که لازمه ان تبدیل پلاسمينوژن غیر فعال به پلاسمين فعال است. فعالیت پلاسمینوژن به عنوان رکن اصلی سیستم فیبرینولیز تحت کنترل فعال کننده ها و مهار کننده های سیستم هموئستاز است.
1-5) فیبرینولیز
مسیر فیبرینولیتیک یک پدیده فیزیولوژیک است که در نتیجه تخریب پروتئولیتیک فیبرین و پلاکت ترومبوز تشکیل شده توسط لخته می باشد.
پلاسمینوژن که توسط کبد ساخته می شود. هنگام ورود به داخل جریان خون به شکل یک مجموعه همراه با مهارکننده PAI-1 می باشد.
پلاسمینوژن توسط عوامل زیر فعال می شود:
الف) Urokinase
ب) فعال کننده پلاسمینوژن بافتی آزاد شده توسط سلول های اندوتلیال [13].
این فعال شدن به خصوص زمانی موثر است که این دو محصول در یک لخته فیبرینی جذب شده باشند.
پلاسمین یک سرین پروتئاز است که نه تنها حل لخته فیبرینی بلکه فیبرینوژن در خون و همچنین برخی از فاکتورهای انعقادی (V، VIII، XIII) را بر عهده دارد.
به این ترتیب یک کاهش روند در سیستم انعقاد رخ می دهد که 12 تا 24 ساعت طول می کشد ، تا زمانی که فاکتورهای لخته شدن دوباره سنتز شوند.
فعالیت پلاسمین در خون توسط آلفا 2 آنتی پلاسمین و همچنین آلفا 2-ماکروگلوبین و آلفا-1-آنتی تریپسین مهار می شود, اما این بازدارنده ها در صورت تجزیه مقدار زیادی پلاسمین اشباع می شوند.
آنزیم های باکتریایی، مانند استرپتوکیناز و استافیلوکیناز همچنین می توانند سبب لیز شدن لخته شوند.
نوع 1 مهار کننده فعال کننده پلاسمینوژن (PAI-I)(Plasminogen Activator Inhibitor) و آنتی پلاسمین A2 (A2-AP)(Antiplasmin –A2) می تواند این آبشار را به ترتیب با مسدود کردن فعالیت پروتئولیتیک t-PA و پلاسمین، مهار کنند[6].
PA I – 1 متعلق به خانواده سرپین می باشد, که گروه بزرگی از پروتئین ها با ویژگی های ساختاری و عملکردی مشابه هستند.خانواده Serpin نقش خود را به عنوان پسودو سوبسترای ایده آل برای پروتئاز سرین را هدف قرار دادند.
مطالعات اخیر نشان داده اند که دو منبع مجزا از PAI-1 موجود در خون وجود دارد که ممکن است از سلول های مختلفی منشا گرفته باشند.
منبع اول PAI-1 توسط سلول های اندوتلیال و یا کبدی ساخته می شود. و منبع دوم از گرانول ها ی پلاکتی است که در حضور یک محرک خاص (به عنوان مثال ترومبین) آزاد می شوند.
تعامل بین -PA t و PAI-1 متصل به فیبرین از سه مرحله متوالی تشکیل شده است:
الف) تعامل از سایت کاتالیزوری از t-PAبا مرکز واکنشی از PAI-1،اتصال به فیبرین، و در نتیجه ایجاد یک مجموعه پایدار است.
ب) پس از تشکیل کمپلکس پایدار با t-PA ، PAI-1 دچار یک تغییر کنفورماسیونی شده که منجر به از دست دادن تمایل آن به فیبرین می شود.
ج) مجموعه اکی مولار-PA t/ -1 PAI از ماتریس فیبرین جدا شده و دوباره به فیبرین متصل می شود [10,11].
گمان می رود که کمپلکس , t-PA/PAI-1 t-PA آزاد برای اتصال محل های یکسان در فیبرین به رقابت بپردازند، و در نتیجه، آبشار فیبرینولیز را از طریق جلوگیری از اتصال-PA t به فیبرین [12] مهار کنند، که تا حد زیادی مانع فعالیت PA- t شوند [13].
1-6) درمان
مراقبت های پزشکی برای بیماران تجربه AMI در طول 40 سال گذشته تغییر کرده است.مراقبت های درمانی در دهه 1960 و 70متمرکز بر درمان آریتمی های جدی و تهدید کننده حیات بود که شامل توسعه مراکز قلب و عروق تخصصی برای نظارت بر این بیماران بود.
در دهه1980 پژوهشهای بالینی برای بررسی اثر داروهایی که سبب شکسته شدن لخته ایجاد کننده انفارکتوس ترومبولیز بود انجام شد.
اگر لخته عامل مسدود شدن شریان حل شود، پرفیوژن مجدد در بافت ایسکمیک رخ داده و این امر می تواند مانع مرگ عضله یا انفارکت شود.هر قدر این فروپاشی لخته زودتر انجام پذیرد پرفیوژن مجدد در عضلات بیشتر می شود.
از بین بردن لخته به وسیله روش های مکانیکی (برهم زدن فیزیکی لخته) و یا به وسیله مواد شیمیایی و داروهایی که انحلال لخته را تسریع می کنند انجام می شود.اگر خونرسانی مجدد به تاخیر بیافتد، عضلات انفارکت شده و می میرند .
اولین بار استفاده از ترومبولیز در AMI (به عنوان مثال با استرپتوکیناز) در اواخر 1950 گزارش شد. بعضی از درمانهای کمکی ضد پلاکتی به ویژه آسپرین نیز مفید است [14].
رژیم های درمانی برای بیماران مبتلا به AMI از طریق دستورالعمل های مبتنی بر شواهد بالینی توسط نهادهای حرفه ای برای داوطلبان ارائه شده است.
در درمان ترومبولیتیک انفارکتوس حاد میوکارد خونرسانی مجدد راهکار اصلی است.
شایع ترین داروهای ترومبولیتیک استرپتوکیناز (نسل اول عامل ترومبولیتیک) و alteplase (فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، PA- t) ، (نسل دوم عامل ترومبولیتیک) هستند.
در این میان، نسل سوم داروهای ترومبولیتیک به عملکرد بالینی رسیده اند.
بسیاری از آنها از alteplase، که در حال حاضر استاندارد طلایی برای درمان thombolytic در سندرم کرونری حاد با بالا رفتن قطعه ST است مشتق شده اند. برجسته ترین موارد در میان آنها reteplase، tenecteplase، و lanoteplase می باشند [2].
درمان با عوامل ترومبولیتیک برای همه بیماران مناسب نمی باشد. به عنوان مثال تاخیر در بهبود در برخی از بیمار پس از شروع علائم ممکن است به این معنی باشد که آنها واجد شرایط برای درمان ترومبولیتیک نیستند.
حتی برای بیمارانی که در مراحل اولیه به آنها رسیدگی شده ممکن است درمان مناسبی نباشد.افزایش ریسک خونریزی پس درمان با داروهای ترومبولیتیک بدان معنی است که تمام بیماران نیاز به غربالگری و بررسی جهت این نوع درمان دارند.با این حال ریسک خونریزی در بیمارانی که نتیجه غربالگری آنها خوب بوده از بین نمی رود.
یکی از موارد خونریزی بسیار شدید می تواند در مغز رخ دهد و متعاقبا خونریزی داخل جمجمه ای فاجعه بار خواهد بود. بنا براین باید مزایا و خطرات درمان ترومبولیتیک به دقت بررسی گردد.
امروزه تزریق وریدی فعال کننده های پلاسمینوژن به عنوان داروهای حل کننده لخته های فیبیرینی یک راهکار مهم درمان ترومبوز می باشد.
1-7) داروهای ترومبولیتیک
لخته یک توده نیمه جامد تشکیل شده از رشته های فیبرین (پروتئین الاستیک مسئول انعقاد) است که می تواند گردش خون را مسدود کند.
محصولات ضد انعقادی مانند آسپرین، ضد ویتامین K، و هپارین به مدت طولانی در درمان و پیشگیری از لخته شدن کاربرد داشتند.
با این حال، این محصولات تنها قادر به کاهش اندازه لخته بودند در حالی که حل سریع و کامل لخته سبب بهبود علائم و نجات جان بیمار می شود.
برای این منظور دارو هایی به نام “داروهای ترومبولیتیک” یا تخریب کننده لخته ساخته شدند.
با این حال، هنوز هم اغلب این داروهای جدید با ضد انعقاد به عنوان درمان مکمل برای جلوگیری از عود تجویز می شوند.
این داروها تبدیل شدن پلاسمینوژن خون به پلاسمین را فعال نموده و در نهایت سبب شکسته شدن فیبرین می شوند.
فیبرین پروتئین ساختاری کلیدی در ترومبوز است و از این رو استفاده از داروهای حل کننده لخته استفاده می شود. همه این داروها به صورت داخل وریدی (IV) تجویز می شوند.
در مراحل اولیه تجویز داروهایی که لخته های تشکیل شده در شریان کرونر را متلاشی وحل می کنند قابل درمان است.
حمله حاد ايسکميک، انفارکتوس حاد ميوکارد و آمبولي ريه، حوادث کشنده‌اي هستند که بدون درمان اورژانس ممکن است به عوارض پيچيده‌اي نظير نارسايي ارگان‌ها و مرگ بيانجامند. در اين زمان، تجويز ترومبوليتيک‌هايي نظير فعال کننده پلاسمينوژن بافتي، با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسيب بافتي و در نهايت نجات بيمار مي‌شود.   تجويز فعال کننده پلاسمينوژن بافتي نوترکيب، در يک واقعه ترومبوآمبوليک حاد، باعث انحلال لخته و برقراري پرفيوژن مجدد ارگان‌ها و جريان يافتن مجدد خون به بافت‌ها مي‌شود.از آنجا که متعاقب درمان با ترومبوليتيک‌ها، خطر وقوع خونريزي مرتبط با درمان وجود دارد، براي هر بيمار بايد منحصرا دارويي موثر و بي‌خطر انتخاب شود.
1-8)جنبه های اقتصادی
درمان با داروهای ترومبولیتیک در مقایسه با درمان با داروهای ضد انعقادی به تنهایی از نظر هزینه بسیار مقرون به صرفه است.
استرپتوکیناز، که کمی کمتر موثر از داروهای دیگر است به دلیل داشتن منشا باکتریایی سبب تحریک سیستم ایمنی شده و خطر تولید آنتی بادی در استفاده از آن وجود دارد.با این وجود در انگلستان، برای درمان اختلالات قلبی و عروقی، به دلیل آن که 6 تا 7 برابر ارزانتر از داروهای دیگر عمدتا مورد استفاده قرار می گیرد.
از سوی دیگر، در کشورهایی مانند فرانسه و ایالات متحده آمریکا، استفاده از فعال کننده پلاسمینوژن توصیه می شود [17].
1-9) تاریخچه داروهای ترومبولیتیک
درمان با داروهای ازسال 1993ترومبولیتیک هنگامی که محیط مایع فیلتر شده حاصل از گونه خاصی از باکتری استرپتوکوک (استرپتوکوک بتا همولیتیک) لخته فیبرینی را حل نمودآغاز شد.
اولیه کاربرد اولیه بالینی استرپتوکیناز در مبارزه با اگزودا فیبروزی پلور، هموتراکس و مننژیت سلی بود [18].
در سال 1958، استرپتوکیناز برای اولین بار در بیماران مبتلا به انفارکتوس حاد میوکارد مورد استفاده قرار گرفت، و این امر سبب تمرکز در درمان با استرپتوکیناز شد.
پتانسیل فیبرینولیتیک ادرار انسان برای اولین بار در سال 1947 شناخته شد و مولکول فعال urokinase نامگذاری شد.
بر خلاف استرپتوکیناز، Urokinase فاقد خاصیت آنتی ژنی بود و به طور مستقیم سبب فعال شدن پلاسمینوژن به پلاسمین می شد و توانایی آن برای کاتالیز تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین تنها به وجود یا عدم وجود لخته فیبرینی در محل وابسته است.
فعال کننده پلاسمینوژن بافتی یک عامل طبیعی فیبرینولیتیک می باشد که در سلول های اندوتلیال عروقی یافت می شود و سبب ایجاد تعادل بین ترومبولیز و ترومبوژنز می باشد و دارای میل پیوندی و ویژگی بالایی جهت اتصال به فیبرین می باشد.
اتصال PA- t و پلاسمینوژن به سطح فیبرینی در محل ترومبوز، باعث ایجاد تغییر کنفورماسیونی شده که تسهیل تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین و حل کردن لخته می شود.
در مراحل اولیه تجویز داروهایی که لخته های تشکیل شده در شریان کرونر را متلاشی وحل می کنند قابل درمان است.
حمله حاد ايسکميک، انفارکتوس حاد ميوکارد و آمبولي ريه، حوادث کشنده‌اي هستند که بدون درمان اورژانس ممکن است به عوارض پيچيده‌اي نظير نارسايي ارگان‌ها و مرگ بيانجامند. در اين زمان، تجويز ترومبوليتيک‌ هايي نظير فعال کننده پلاسمينوژن بافتي، با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسيب بافتي و در نهايت نجات بيمار مي‌شود..تجويز فعال کننده پلاسمينوژن بافتي نوترکيب، در يک واقعه ترومبوآمبوليک حاد، باعث انحلال لخته و برقراري پرفيوژن مجدد ارگان‌ها و جريان يافتن مجدد خون به بافت‌ها مي‌شود.از آنجا که متعاقب درمان با ترومبوليتيک‌ها، خطر وقوع خونريزي مرتبط با درمان وجود دارد، براي هر بيمار بايد منحصرا دارويي موثر و بي‌خطر انتخاب شود.
1-10)روش های مقابله با ترومبوآمبولی
در بدن انسان سیستم هایی جهت ایجاد تعادل و جلوگیری از بروز تومبوز وجود دارد.
1-مکانیسم ضد فعالیت پلاکتی
2-مکانیسم ضد انعقادی
3- عوامل تجزیه کننده فیبرین مانند u-PAو t-PA
چنانچه لخته ایجاد شود مکانیسم 1و 2 قادر به از بین بردن لخته نخواهند بود و این دو مکانیسم صرفا نقش پیشگیری از بروز لخته را دارند.اما مکانیسم 3 قادر به از بین بردن و بر طرف ساختن ترومبوز و لیز لخته می باشد.
فعال‌کننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA)، يک پپتيد طبيعي است که با اتصال به فيبرين موجود در يک لخته، فيبرينوليز را آغاز کرده و پلاسمينوژن را به پلاسمين فعال تبديل مي‌کند. اين روند باعث شکسته شدن فيبرين، فيبرينوژن و ساير پروتئين‌هاي انعقادي خواهد شد.
t- PA انسانی اولین بار از بافت رحم به میزان 1 میلی گرم از 5 کیلوگرم بافت تخلیص شد.
یک گلیکو پروتئین دارویی با 5 دومن هSerine protease , Kringle1 ,Kringle2, Epidermal growth factor, Finger با 527 امینو اسید, سه زنجیره اولیگو ساکاریدی, یک زنجیره از نوع O-linked , 35 اسیدآمینه سیستئین,17 باند دی سولفیدی و وزن مولکولی 67 کیلو دالتون سرین پروتئازی است که به دلیل ایجاد تعادل بین پدیده ترومبولیز و ترومبوژنز درسیستم فیبرینولیتیک حائز اهمیت می باشد. ژن t-PA روی بازوی کوتاه کروموزوم 8 انسان قرار دارد.
در کنار دومن K2 دومن سرین پروتئازی وجود دارد که در انتهای C خود دارای یک سایت کاتالیتیک می باشد. هر دو دومنF و K2 به فیبرین متصل می شوند و سبب تسریع فعال شدن پلاسممینوژن توسط t-PA می شوند.نیمه عمر t-PA کامل به دلیل کلیرانس کبدی که ناشی از شناسایی 3 دومن اولیه انتهای آمینی آن توسط گیرنده های کبدی می باشد کوتاه است.
1-11)تجزیه لخته های فیبرینی
t-PA فعال کننده اصلی پلاسمینوژن در خون است در حالی که u-PA پروتئولیز در بافت راانجام می دهد و نسبت بهt-PA اثر کمتری درلیز فیبرین داخل عروقی دارد.
فرایند فیبرینولیز در سطح فیبرین اغاز شده و انتشار می یابد .وجود این سطح جایگاه اتصال جهت تماس بهینه اجزای سیستم فیرینولیتیک مانند پلاسمینوژن و t-PA را فراهم می کند.
این امرسبب رسوب حجم زیادی از پلاسمینوژن و t-PA در رسوبات فیبرین می شود و فعالیت پلاسمین دراین بخش افزایش می یابد.
فرایند تنظیم مهاری توسط مهار کننده فعال کننده پلاسمینوژن PAI-I)) و مهار کننده پلاسمین انجام می پذیرد.
مهمترین مهار کننده t-PA در پلاسماست و بخش اعظم t-PA گردش خون به این مهار کننده اتصال می یابد.
در بدن میان تشکیل فیبرین و حذف آن تعادل وجود دارد و وجود هر گونه اختلال به دلیل شرایط پاتولوژیک یا نقایص ژنتیکی موجب به هم خوردن این تعادل شده و متعاقبا خونریزی های شدید اتفاق می افتد.
1-12)مهار کننده های t-PA
جهت مهار فعالیت t-PA در شرایط فیزیولوژیک تعدادی مهار کننده در پلاسما و مایعات بدن شناسایی شده اند که شامل:
PAI-I)) (PAI-II) (مهار کننده فعال کننده پلاسمینوژن جفتی) و PAI-III (مهار کننده پروتئین C) و Trypin inhibitorو Protease nexin و ماکروگلوبین و CI-inhibitor می باشد.
PAI-I)) موثرترین مهار کننده t-PA می باشد و یک مهار کننده سرین پروتئاز (Serpin) می باشد که به عنوان سویسترای کاذب برای پروتئاز هدف خود عمل می کند و با آن کمپلکس غیر فعال و هم مولار تشکیل می دهد.یعنی به جایگاه فعال آن متصل می شود.
این مهار کننده t-PA را به وسیله تشکیل کمپلکس میان جایگاه فعال t-PA و اسیدهای آمینه به دام اندازنده Arg346-Met347 در ساختار خور مهار می کند.
PAI-I)) جز خانواده Serpinها می باشد و به دوشکل فعال و غیر فعال است .فرم فعال آن به طور خود به خود فعالیتش را از دست می دهد و نیمه عمری حدود نیم ساعت دارد. فرم غیر فعال آن حاصل تجزیه فرم فعال است.
PAI-I)) توسط سلول های اندوتلیال و هپاتوسیت ها ساخته شده و در پلاکت ها, جفت و سرم دیده می شود.
در آزمایش های تعیین آنتی ژن نشان داده شده که پلاکتها دارای 90% PAI-I)) در خون هستند. PAI-I)) مشتقی از پلاکت 50-80% فعالیت PAI-I )) را تشکیل می دهد.
غلظت طبیعی و میزان فعالیت PAI-I)) در پلاسما به ترتیب 50-5 میکروگرم در لیتر و 0-40 IU/ml می باشد.
PAI-I)) دارای تنوع روزانه در طول روز می باشد به طوریکه مقدار آن در بعد از ظهر کمتراز صبح است [24].
مهار کننده اصلی u-PA در پلاسماست و یک Serpin با وزن مولکولی 47 کیلودالتون می باشد که میل الحاقی بالاتری برای u-PA نسبت به t-PA دارد.
در پلاسمای افراد غیر باردار به سختی قابل تشخیص است .در سه ماهه سوم بارداری میزان آن در پلاسما 100 میکروگرم در لیتر می باشد.
این مهار کننده قادر به مهار نوع تک زنجیره ای t-PA نیست و تاثیر آن برای مهار t-PA دو زنجیره ای 100 برابر نسبت به PAI-I)) کمتر است.
PAI-I)) بیشترین تاثیر را روی u-PA دارد و نقش اصلی آن تنظیم u-PAی خارج سلولی است.
1-12-1) 2 α آنتی پلاسمین
یک گلیکو پروتئین تک زنجیره ای که به طور غالب در کبد سنتز می شود.مهار کننده اصلی در پلاسمای انسان می باشد و پلاسمین را غیر فعال می کند [24].
1-12-2) 2 α ماکروگلوبین
پلاسمین را با میزان کمتری نسبت به 2α آنتی پلاسمین مهر می کند به همین دلیل در رابطه با اینکه تنظیم کننده تجزیه فیبرین باشد هنوز تردید زیادی وجود دارد [24].
1-12-3) TAF-I)) Thrombin Activable Fibrinogen Inhibitor
TAF- I )) تنظیم کننده دیگری برای تجزیه فیبرین است مکانیسم خاصی تولید ترومبین را کنترل می کند.
ترومبین باعث فعال شدن TAF-I)) می شود و در این واکنش بیش ار 1000 برابر در حضور ترمبومدولین تولید شده توسط سلولهای اندوتلیال افزایش می یابد.
ترومبومدولین یک اتصال مولکولی میان انعقاد خون و سیستم تجزیه کننده لخته برقرار می کند.ترومبومدولین ترومبین را به یک آنزیم ضد تجزیه کننده لخته تبدیل می کند و مستقیما سبب فعال شدن TAF-I)) می شود.
TAF-I)) تجزیه فیرین را از طریق جداسازی اسیدهای آمینه لیزین انتهای کربوکسیلیک مونومرهای فیبرین حذف پلاسمینوژن و جایگاه های اتصال t-PA مهار می نماید [24].
1-13)سنتز t-PA
t-PA عمدتا در سلولهای اندوتلیال عروقی سنتز می شود و به طور پیوسته به پلاسما ترشح می گردد.نواحی مختلف سسیستم عروقی مقادیر مختلفی از t-PA راترشح می کنند و حد نهایی ترشح چهار برابر حد پائینی آن می باشد.
t-PA به شکل تک زنجیره ای فرم طبیعی ترشح شده از سلولهای اندوتلیال می باشد در حالی که فرم دو زنجیره ای نتیجه فعالیت پروتئولیتیک پلاسمین روی فرم تک زنجیره ای می باشد.هر دو فرم از لحاظ کاتالیتیک فعال هستند و خواص آنزیمی مشابهی در حضور فیبرین دارند.
1-14)میل الحاقی به فیبرین
در غیاب فیبرین به دلیل میل الحاقی خفیف t-PA به پلاسمینوژن t-PA فعال کننده پلاسمینوژن نسبتا خفیفی می باشد.
البته t-PA میل الحاقی زیادی برای فیبرین دارد و اتصالش به فیبرین فعالیت آنرا 1000 برابر افزایش می دهد.این افزایش شدید به محل های اتصال اختصاصی روی سطح فیبرین نسبت داده می شود که سبب متراکم شدن و جهت گیری صحیح t-PA با سوبسترای خود یعنی پلاسمینوژن می گردد و به این ترتیب تجزیه لخته را به صورت موثر پیش می برد.
1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر
حد پایه غلظت t-PA در پلاسمای گرفته شده از یک فرد سالم در حالت استراحت در صبح هنگامی که با روش های ایمونولوژیک اندازه گیری شود برابر با 5 میکروگرم در لیتر می باشد [28].
این در حالی است که فعالیت اندازه گیری شده در همین زمان IU/ml5/0 که معادل 1 میکروگرم در لیتر است می باشد [29].
این اختلاف بین مقدار آنتی ژن و سطح فعالیت می تواند به این امر مربوط باشد که اکثر t-PA پلاسما به شکل کمپلکس غیر کارا و عمدتا با مهار کننده اصلی آن PAI-I می باشد.
البته افزایش حاد در سطح t-PA در پاسخ به محرک هایی مثل ورزش ,استرس روحی ,گرفتگی سیاهرگ و بعضی از داروها دیده می شود. t-PAبه وسیله متابولیسم سریع کبدی از گردش خون حذف می شود [30].
نیمه عمر طبیعی برای t-PA آزاد حدود 6 دقیقه است.این مقدار در بیماری های دارای تمایل به تشکیل لخته که درآنها سطح PAI-I افزایش دارد به طور قابل توجهی کاهش می یابد [31].
t-PA مشتق شده از Bowes melanoma از یک زنجیره پلی پپتیدی با 527 آمین اسید تشکیل شده است.در ساختار گلیکوپروتئین آن 10-7%وزن کل را کربوهیدرات تشکیل می دهد.5 مکان برای گلیکوزیلاسیون در این مولکول شناخته شده است. pH ایزوالکتریک آن 5/7 می باشد.
پروتئولیز به وسیله پلاسمین در محیط خارج سلولی این زنجیره را بین Ile276 و Arg275 می شکند و آن را به فرم دو زنجیره ای تبدیل می کند.این زنجیره به وسیله یک باند دی سولفیدی منفرد به هم متصل می مانند.فرم های تک زنجیره ای و دوزنجیره ای t-PA تفاوت بسیار کمی در خاصیت فیبرینولیتیک خود نشان می دهد. [2,32]
1-16)ساختار دومن ها
چندین ناحیه عملکردی در t-PA شناسایی شده است.
1-دومن متصل شده به فیبرین به نام دومن انگشتی نزدیک به N ترمینال
2-دومن فاکتور رشد اپیدرمال که در چندین سرین پروتئاز دیگر وجود دارد.
3-دو ساختار که با پیوند های دی سولفیدی حلقه ای شده اند.( K1وk2)
و مشابه آن در پلاسمینوژن , پروترومبین و u-PA مشاهده می شود.
4-دومن سرین پروتئاز در C ترمینال مولکول که جایگاه فعال آنزیم می باشد و دارای خاصیت پروتئولیتیک است.
این دومن ها شامل آمینو اسیدهای سرین, هیستیدین و آسپارتیک اسید می باشد که در ساختمان اولیه پروتئین در فواصل نسبتا دوری از یکدیگر قرار گرفته اند.اما در فرم تا خورده پیچیده در نزدیکی هم واقع می شوند.این ناحیه باند Val562-Arg651 را در پلاسمینوژن می شکند و درنتیجه آن را به پلاسمین فعال تبدیل می کند.
دومن های K1,Fو K2 دارای خاصیت اتصال به فیبرین هستند به همین دلیل دردرمان ترومبوز از لحاظ اختصاصی بودن دراتصال به لخته مهم هستند.دومن فاکتور رشد اپیدرمال در کلیرانس سریع کبدی این مولکول نقش دارد [34].
1-17)تاریخچه درمان تجزیه لخته
در سال 1933 یعنی زمانی که ازمحیط کشت مایع سویه باکتری های استرپتوکوکوس بتا همولیتیک کشف شد توانستند لخته های فیبرینی را حل کنند [35,36].
این کار به واسطه آنزیم استرپتوکیناز انجام می شد.
در سال 1947 توانایی تجزیه لخته توسط ادرار انسان برای اولین بار شرح داده شد و در سال 1958 استرپتوکیناز برای اولین بار جهت درمان انفارکتوس قلبی مورد استفاده قرار گرفت.
ماده موجود در ادرار مولکول فعالی است که اوروکیناز ناممیده می شود.این ماده بر خلاف استرپتوکیناز آنتی ژنیک نبوده و مستقیما پلاسمینوژن را به شکل پلاسمین فعال تبدیل می کند [37].
1-18)داروهای تجزیه کننده فیبرین
این داروها را می توان به چند دسته تقسیم نمود:
1-استرپتوکیناز
2-Anistreplase
3-Urokinase
4Alteplase ,Active-
5- دو مشتق نوترکیب از rt-PA شامل Reteplase و Tenecteplase
1-19)طبقه‌بندي داروهاي ترومبوليتيک
ترومبوليتيک‌هاي مورد تاييد سازمان غذا و داروي آمريکا شامل پنج دارو هستند.
در بدن 2 منبع پلاسمینوژنی وجود دارد.:
الف-پلاسمینوژن درحال گردش Circulating Plasminogen))
ب-پلاسمینوژن مجاور فیبرین Fibrin –bound Plasminogen))
برخی از انواع فعال کننده پلاسمینوژن تنها پلاسمینوژن مجاور فیبرین را فعال می کنند.بنابراین فعال کننده های Fibrin-Specific نامیده می شوند .در مقابل فعال کننده هایی وجود دارند که کاملا به صورت غیر اختصاصی عمل نموده و پلاسمینوژن سیار و غیر سیار را فعال می کنند.
این دسته از فعال کننده ها علاوه بر فیبرین روی فیبرینوژن و دیگر فاکتورهای انعقادی تاثیر گذاشته و آنها را تجزیه می کنند.این روند Systemic lytic state نامیده می شود.چنین شرایطی سبب کاهش توان هموستاتیک و افزایش خطر خونریزی می شود.این حالت ممکن است در اثر استفاده از دوزهای بالای فعال کننده پلاسمینوژن در پلاسما ایجاد شود.
عوامل تجزیه کننده لخته به دو دسته تقسیم می شنود:
1- Fibrin specific agents مانند t-PA
2-Non fibrin specific agents مانند اوروکیناز و استرپتوکیناز
1-20)انواع فعال کننده های پلاسمینوژن
تاکنون سه نسل فعال کننده پلاسمینوژن به بازار معرقی شده است.
داروهای تجزیه کننده نسل اول:
1-استرپتوکیناز 2-اوروکیناز 3-استافیلوکیناز
داروهای تجزیه کننده نسل دوم:
1- Alteplase
2- (APSAC) Acylated plasminogen Streptokinase activator complex
داروهای تجزیه کننده فیبرین نسل سوم:
1-Reteplase r-PA))
2-TNkase Tenecteplase))
3-nPA Lanoteplase))
عوامل فیبرینولیتیک مشتق از سایر منابع:
1-Saruplase (Pro-urokinase)
2-Alfimprose
الف-Anistreplase
ب- Vampire bat Plasminogen Activator(dsPA)
شکل(1-4)
پروتئین t-PA آنزیمی است که به دلیل ویژگی متمایزی که نسبت به سایر تجزیه کننده های فیبرین ها دارد به عنوان انتخاب اول درمان مطرح است.
تولید دارو نیاز مند روش موثر و کارا با بازدهی مناسب و خلوص بالاست.به هر حال در مطالعات اولیه از t-PA تولید شده توسط سلولهای ملانوما در مقدار نسبتا زیاد استفاده شده است.
روش های تولید فعلی به سلول های نوترکیب با تولید بالا متکی هستند.علی رغم بازده افزایش یافته همچنان قیمت t-PA در بازار بالاست . هر گرم t-PA 22000 دلار می باشد که بیست برابر قیمت استرپتوکیناز می باشد.بنابراین بهینه کردن تولید توسط میزبان های مختلف به منظور کاهش قیمت و بهبود فعالیت و همچنین کاهش عوارض احتمالی از مهمترین اهداف تحقیقاتی می باشد.
1-20-1) Streptokinase
استرپتوکیناز که قدیمی ترین و ارزانترین فعال کننده پلاسمینوژن با منشا خارجی است به میزان زیادی در ایران مصرف می شود. این دارو از استرپتوکوک بتا همولیتیک گروه C تهیه می شود و از جمله فعال کننده های غیر مستقیم پلاسمینوژن می باشد.
استرپتوکیناز دارای 414 اسید امینه و وزن مولکولی Kd47 می باشد..به دلیل خطر خونریزی مغزی, خونریزی در محل ورود کاتتر و واکنش های آلرژیک در مصرف ان محدودیت وجود دارد.
استرپتوکیناز کمپلکس های استوکیومتریک 1:1 با پلاسمینوژن تشکیل می دهد و از این طریق سبب تحریک تغییرات ساختار 3 بعدی در پلاسمینوژن شده و جایگه فعال آن را در معرض قرار می دهد.
پس از این تغییرات ساختار 3 بعدی پلاسیمینوژن مولکولهای پلاسمینوژن دیگر به پلاسمین تبدیل می شوند.
استرپتوکیناز قادراست سبب فعال سازی میزان زیادی از پلاسمینوژن شده و در نتیجه میزان کافی از پلاسمین را برای چیره شدن به 2α آنتی پلاسمین ایجاد می کند. درنتیجه این پلاسمین ها قادرند علاوه بر تخریب فیبرین در لخته های خونی باعث تجزیه فیبرینوژن هم شده و در نهایت Systemic lytic state را تحریک نموده و سبب خونریزی شوند.
علاوه بر این استرپتوکیناز به شدت آنتی ژنیک بوده و در بدن سبب افزایش



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

دیدگاهتان را بنویسید