وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری
پژوهشکده زیستفناوری پزشکی
پایاننامه كارشناسي‌ ارشد
در رشته زیستشناسی سلولی- مولکولی
عنوان:
تاثیر کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشهای بر بیان ژنهای
اختصاصی اندودرم اولیه رویان موش
پژوهشگر:
پریناز کاظمی
اساتید راهنما:
دکتر مجتبی دشتیزاد
دکتر قاسم آهنگری
استاد مشاور:
دکتر مهدی شمسآرا
اسفند ماه سال 1393
تقدیر و تشکر
سپاس خدای را که سخنوران، در ستودن او بمانند و شمارندگان، شمردن نعمتهای او ندانند و کوشندگان، حق او را گزاردن نتوانند. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید.
نهال را باران باید تا سیرابش کند از آب حیات و آفتاب باید تا بتاباند نیرو را و محکم کند شاخههای تازه روییده را؛ بسی شایسته است از اساتید فرهیخته و بزرگوارم جناب آقای دکتر دشتیزاد که با هدایت و حمایتهای بیدریغشان یاریام نمودند و برایم زندگی کردن و انسان بودن را معنا کردند و جناب آقای دکتر مهدی شمسآرا که همواره آسمان صبر و دشت علمشان فرا راه تلاشم بوده است، تقدیر و تشکر نمایم.
همچنین از جناب آقای دکتر آهنگری کمال تشکر و قدردانی را دارم و از خداوند منان سلامت و سعادت ایشان را خواستارم.
سپاس آخر را به دوست و همکار عزیزم، سرکار خانم فروغ مهدوینژاد، که صادقانه و صمیمانه مرا در انجام این پروژه یاری نمود تقدیم مینمایم.
باشد که این، خردترین بخشی از زحمات آنان را سپاس گوید.
ما حصل آموختههایم را ضمن تشکر و سپاس بیکران تقدیم میکنم به
خانوادهی عزیزم، آنان که مهر آسمانیشان آرام بخش آلام زمینیام است. هرچه آموختم در مکتب عشق آنان آموختم و هرچه بکوشم قطرهای از دریای بیکران مهربانیشان را سپاس نتوان بگویم.
چکیده فارسی
مطالعات انجام شده در سالهای اخیر نشان میدهند که سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد شیشهای، در بهبود کیفیت رویانهای ذوب شده موثر است. اما در این مطالعات، به نقش آب درون حفره و تاثیر آن بر روی تشکیل ردههای سلولی بلاستوسیست، توجه نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، علاوه بر ارزیابی نرخ زندهمانی و خروج از زونا، اثر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشهای، بر روی میزان بیان ژنهای Gata6 و Grb2 در بلاستوسیست درونتنی و برونتنی منجمد-ذوب شده و سوراخ شده قبل از انجماد بررسی شد و با گروه کنترل مقایسه گردید. در این مطالعه، میزان خروج از زونا با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست قبل از انجماد، بهصورت معنیداری افزایش یافت. این در حالی است که میزان زندهمانی در گروههای تحت تیمار، مشابه با گروه کنترل، بالا بود. انجماد شیشهای موجب افزایش در میزان بیان ژنهای Gata6 و Grb2 شد (p<0.05). اما با کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد، در بلاستوسیستهای درونتنی، میزان بیان این ژنها نسبت به گروه انجماد شیشهای بهصورت معنیداری کاهش پیدا کرد و به گروه کنترل نزدیک شد (p<0.05). در حالی که در مورد بلاستوسیستهای برونتنی، با استفاده از این تکنیک، بیان ژن Grb2 افزایش پیدا کرد ولی تفاوت معنیداری در میزان بیان ژن Gata6 نسبت به گروه انجماد شیشهای ایجاد نشد. از آنجایی که هیچ نتیجهای مبنی بر تاثیر منفی استفاده از این تکنیک مشاهده نگردید و با توجه به افزایش میزان خروج از زونا، کاهش حجم مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشهای میتواند مفید واقع شود.
کلمات کلیدی: لقاح آزمایشگاهی، انجماد شیشهای، سوراخ کردن مصنوعی، بیان ژن، Real Time PCR
فهرست مطالب
1 مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده…………………………………………………………..2
1-1 تکوین پیش از لانهگزینی در موش…………………………………………………3
1-1-1 لقاح3
1-1-2 تکوین اولیه5
1-1-3 مکانیسمهای مولکولی دخیل در لایهزایی رویان9
1-1-3-1 جدایی دو ردهی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی10
1-1-3-2 جدایی دو ردهی سلولی اپیبلاست و اندودرم اولیه11
1-2 تکنیکهای کمک باروری…………………………………………………………13
1-2-1 لقاح آزمایشگاهی13
1-2-1-1 کیفیت سلول تخم14
1-2-2 کشت آزمایشگاهی رویان15
1-2-3 انجماد16
1-2-3-1 اصول انجماد17
1-2-3-2 مواد سرما محافظ18
1-2-3-3 روشهای انجماد19
1-2-3-3-1 انجماد آهسته20
1-2-3-3-2 انجماد شیشهای21
1-2-4 سوراخ کردن مصنوعی22
2 مواد و روشها…………………………………………………………………………………….25
2-1 حیوان…………………………………………………………………………..25
2-2 تولید رویان آزمایشگاهی…………………………………………………………………26
2-2-1 استحصال اسپرم26
2-2-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها26
2-2-1-2 جابجایی مهرهی گردنی27
2-2-1-3 تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم28
2-2-1-4 جمعآوری و ظرفیتپذیری اسپرم29
2-2-2 استحصال تخمک31
2-2-2-1 تحریک تخمکگذاری31
2-2-2-1-1 تزریق داخل صفاقی31
2-2-2-2 آمادهسازی محیط و قطرهها32
2-2-2-3 جابجایی مهرهی گردنی32
2-2-2-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولهی تخمبر32
2-2-2-5 جداسازی تودهی تخمک-کومولوس33
2-2-3 لقاح آزمایشگاهی34
2-2-3-1 آمادهسازی محیط و قطرهها34
2-2-3-2 لقاح35
2-2-4 کشت آزمایشگاهی35
2-2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها35
2-2-4-2 کشت رویان36
2-3 تولید رویان درونتنی…………………………………………………………….37
2-3-1 تحریک تخمکگذاری و جفت اندازی موشها37
2-3-2 آمادهسازی محیط و قطرهها37
2-3-3 جابجایی مهرهی گردنی37
2-3-4 تشریح موش ماده و جداسازی لولههای رحمی37
2-3-5 استحصال بلاستوسیست38
2-4 سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست………………………………………………39
2-4-1 آمادهسازی محیط و قطرهها39
2-4-2 آمادهسازی و تنظیم دستگاه ریزدستکاری40
2-4-3 روش کار40
2-5 انجماد رویان……………………………………………………………………41
2-5-1 انجماد شیشهای41
2-5-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها41
2-5-1-2روش کار42
2-5-2یخگشایی43
2-5-2-1 آمادهسازی محیط و قطرات43
2-5-2-2روش کار44
2-6 بررسی بیان ژن………………………………………………………………………………………..45
2-6-1 استخراج RNA از بلاستوسیست45
2-6-2 ساخت cDNA46
2-6-3 طراحی پرایمر47
2-6-4 رقیقسازی پرایمرها47
2-6-5 واکنش زنجیرهای پلیمراز48
2-6-6 ژل الکتروفورز محصولات PCR49
2-6-7 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی49
2-7 طراحی آزمایش…………………………………………………………………52
2-7-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش، قبل از انجماد شیشهای………….52
2-7-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش، قبل از انجماد شیشهای…………..52
2-7-3 آنالیز آماری52
3 نتایج………………………………………………………………………………………………………………54
3-1 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای درونتنی موش قبل از انجماد شیشهای……………54
3-1-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا54
3-1-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb256
3-1-2-1 واکنش زنجیرهای پلیمراز56
3-1-2-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی57
3-2 کاهش مایع بلاستوسل رویانهای برونتنی موش قبل از انجماد شیشهای……………62
3-2-1 نرخ زندهمانی و خروج از زونا62
3-2-2 بیان نسبی ژنهای Gata6 و Grb264
4 بحث و نتیجهگیری………………………………………………………………………67
5 فهرست منابع…………………………………………………………………………..76
6 پیوستها………………………………………………………………………………83
فهرست جداول
جدول ‏11: ترکیبات محیط HTF14
جدول ‏12: ترکیبات محیط KSOM16
جدول ‏21: محلولهای مورد نیاز برای انجماد شیشهای بلاستوسیست موش42
جدول ‏22: محلولهای مورد نیاز برای یخگشایی بلاستوسیست موش44
جدول ‏23: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA46
جدول ‏24: چرخههای حرارتی ساخت cDNA46
جدول ‏25: مشخصات پرایمرهای طراحی شده47
جدول ‏26: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز48
جدول ‏27: چرخههای حرارتی مراحلPCR 48
جدول ‏28: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR50
جدول ‏29: چرخههای حرارتی Real Time PCR50
جدول ‏31: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درونتنی موش55
جدول ‏32: میزان زندهمانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برونتنی موش.63
فهرست اشکال
شکل ‏11: مراحل مختلف تکوین پیش از لانهگزینی در موش2
شکل ‏12: بخشهای مختلف لولهی تخمبر3
شکل ‏13: فرایند گامتزایی4
شکل ‏14: اسپرم و تخمک پستانداران5
شکل ‏15: قطبیت رویان موش.6
شکل ‏16: تقسیم مرحلهی 8 به 16 سلولی7
شکل ‏17: تشکیل حفرهی بلاستوسل.7
شکل ‏18: آرایش سیستمهای انتقالی در سلولهای تروفواکتودرم8
شکل ‏19: بلاستوسیست در حال خروج از زونا9
شکل ‏110: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش.10
شکل ‏111: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپیبلاست در سه مرحله11
شکل ‏112: دخالت مسیر پیامرسان FGF/MAPK 13
شکل ‏113: فرایند شیشهای شدن محیط انجماد.21
شکل ‏114: روشهای مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفرهی بلاستوسل.24
شکل ‏21: قفسهای دارای سیستم تهویهی مجزا26
شکل ‏22: پتری دیش استحصال اسپرم27
شکل ‏23: جابجایی مهرههای گردنی28
شکل ‏24: تشریح موش نر 29
شکل ‏25: جمعآوری اسپرم30
شکل ‏26: نحوهی جمعآوری اسپرمهای زنده از حاشیهی قطرهی محیط کشت30
شکل ‏27: نحوهی ترزیق داخل صفاقی موش31
شکل ‏28: پتری دیش استحصال تخمک32
شکل ‏29: جداسازی لولهی تخمبر33
شکل ‏210: جداسازی تودهی تخمک-کومولوس34
شکل ‏211: پتری دیش IVF34
شکل ‏212: تخمک-کومولوسهای مجزا35
شکل ‏213: نحوهی قطرهگذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان36
شکل ‏214: جداسازی لولههای رحمی.38
شکل ‏215: استحصال بلاستوسیست از لولهی رحمی39
شکل ‏216: پتری دیش ریز دستکاری40
شکل ‏217: نحوهی سوراخ کردن حفرهی بلاستوسیست41
شکل ‏218: نحوهی قطرهگذاری محلولهای انجماد شیشهای42
شکل ‏219: موقعیت قرار گیری بلاستوسیست بر روی کرایوتاپ 43
شکل ‏220: پتری دیش حاوی محلول یخگشایی44
شکل ‏31: بلاستوسیستهای درونتنی موش بعد از انجماد-ذوب در محیط KSOM..56
شکل ‏32: الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز.57
شکل ‏33: منحنی استاندارد ژنهای Grb2، Gata6 و B2m 58
شکل ‏34: منحنی تکثیر ژنهای Grb2، Gata6 و B2m59
شکل ‏35: منحنیهای ذوب مربوط به ژنهای Grb2، Gata6، B2m.60
شکل ‏36: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata661
شکل ‏37: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb262
شکل ‏38: مراحل مختلف رشد و تکوین رویان موش پیش از لانهگزینی63
شکل ‏39: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Gata664
شکل ‏310: اثر تیمارهای مورد آزمایش بر روی بیان نسبی ژن Grb2 65
لیست اختصاراتوزن مولکولیMWمولارMمیلیمولارmMپیکومولPmلیترLمیلیلیترMlمیکرولیترµlکیلوگرمkg گرمGمیلیگرمMgمیکروگرمµgنانوگرمNgمیکرومترµmنانومترNmواحد بینالمللیIUنوکلئوتیدNtمیلیاسمولm.OsmثانیهSدرجه سلیسیوس°Cجفت بازbp
1 مقدمه و مروری بر مطالعات انجام شده
تکوین قبل از لانهگزینی1، در همهی پستانداران با یک سلول منفرد به نام تخم2 آغاز میشود و با ایجاد بلاستوسیست3 از طریق چندین تقسیم متوالی، پایان مییابد (Rossant and Tam, 2009). مطالعه در مورد رخدادهای این دوره، برای افزایش موفقیت در تکنیکهای کمک باروری4 الزامی است. بیشتر اطلاعات ما دربارهی تکوین قبل از لانهگزینی، از مطالعه بر روی موش بدست آمده است. از مزایای استفاده از موش میتوان به تعداد نژادهای بسیار زیاد، تشابه ژنتیکی بالا با انسان، ارزان بودن گونهی موش نسبت به سایر گونهها، دوران بارداری کوتاه، تعداد زیاد نوزادان در هر دورهی بارداری، سایز کوچک و نگهداری آسان اشاره کرد. بر همین اساس، استفاده از این مدل آزمایشگاهی در تحقیقات مربوط به فرایندهای تولیدمثلی و تکنیکهای کمک باروری رایج میباشد.
شکل ‏11: مراحل مختلف تکوین پیش از لانهگزینی در موش (Oron and Ivanova, 2012).
1-1 تکوین پیش از لانهگزینی در موش
1-1-1 لقاح5
در پستانداران، ترکیب اسپرم و تخمک طی فرایند لقاح، منجر به تشکیل سلول تخم میگردد. محل انجام این فرایند، ناحیهی ابتدایی لوله تخمبر6 به نام آمپولا7 است (شکل ‏12) که دمای آن حدود 2 درجه سانتیگراد نسبت به دیگر نواحی لوله، گرمتر گزارش گردیده است (Daulat, 2012).
شکل ‏12: بخشهای مختلف لولهی تخم بر(Ikawa et al., 2010).
سلولهای جنسی شرکت کننده در لقاح، در بدن جاندار نر و ماده، طی فرایند گامتزایی8 ایجاد میشوند (شکل ‏13). اسپرم تولید شده طی گامتزایی هنوز قابلیت لقاح ندارد و برای حصول توانایی لازم برای بارورسازی تخمک، باید تحت فرایندی قرار بگیرد که ظرفیتپذیری9 نام دارد. طی این فرایند که با ورود اسپرم به بدن جاندار ماده انجام میگیرد، تغییرات فیزیولوژی متنوعی درنواحی سر، آکروزوم10 و دم این سلول جنسی رخ میدهد (شکل ‏14).

شکل ‏13: فرایند گامتزایی که بهصورت اسپرمزایی در جنس نر (A) و تخمکزایی در جنس ماده (B) انجام میپذیرد (Brevini and Pennarossa, 2013)
بعد از ظرفیتپذیری، قدم نهایی آمادهسازی اسپرم برای لقاح، واکنش آکروزومی11 است (شکل ‏14) که طی آن آنزیم و پروتئینهای متنوعی از آکروزوم آزاد میشود و به عبور اسپرم از توده سلولی متراکم12 و غشای شفاف13 اطراف تخمک (شکل ‏14) کمک میکند. فقط اسپرمهایی که از نظر واکنش آکروزومی فعال شدند، قدرت اتصال به تخمک را دارند (Okabe, 2013). پس از برقراری این اتصال، غشای پلاسمایی اسپرم و تخمک با یکدیگر ترکیب میگردند. با نفوذ اسپرم، تخمک فعال میشود و با آزادسازی گرانولهای قشری14 خود، از اتصال سایر اسپرمها به غشای شفاف و در نتیجه ایجاد پلیاسپرمی جلوگیری میکند (Burkart et al., 2012). نتیجهی یک لقاح موفقیت آمیز، ترکیب پیش هستههای15 نر و ماده و تشکیل سلول تخم است.
شکل ‏14: اسپرم و تخمک پستانداران الف: تغییرات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی اسپرم به منظور آماده شدن برای لقاح، که در ابتدا ظرفیتپذیری و در ادامه واکنش آکروزومی را شامل میشود ب: تخمک آزاد شده از تخمدان که با توده سلولی متراکم پوشیده شده و توسط غشای شفاف از آن جدا گردیده است (Okabe, 2013).
1-1-2 تکوین اولیه
پس از لقاح، سلول تخم ایجاد شده، طی تقسیمات اولیهای که تسهیم16 نامیده میشوند، سلولهای کوچکتری به نام بلاستومر17 ایجاد میکند. یکی از وقایع مهمی که حین این تقسیمات رخ میدهد، فعال شدن ژنوم سلول تخم18 است که طی آن کنترل سلول از حالت مادری به حالت زیگوتی تغییر میکند. به عبارت دیگر رونوشتهای مادری تجزیه میشوند و رونویسی از روی ژنوم سلول تخم آغاز میگردد. در موش، این تغییر در اواخر مرحلهی تک سلولی و مرحلهی دو سلولی رخ میدهد (Cockburn and Rossant, 2010).
ادامهی این تقسیمها، رویان19 را وارد مرحلهی چهار سلولی و سپس هشت سلولی میکند. در این مرحله، اتصالات بین سلولی20 افزایش پیدا میکند. بلاستومرها از حالت کروی خارج میشوند و رویان شکل فشردهتری به خود میگیرد. این فرایند که لازمهی رخدادهای مورفولوژیکی بعدی است متراکم شدن21 نام دارد (شکل ‏11).
تا این مرحله، بلاستومرها هیچگونه قطبیت22 داخل سلولی از خود نشان نمیدادند اما با ورود به مرحلهی فشردگی و همزمان با افزایش اتصالات بین سلولی، همهی بلاستومرها، در راستای محور عمود بر اتصالات سلولی، قطبی شده و دو ناحیهی راسی23 و پایهای24 را شکل میدهند (شکل ‏15) (Cockburn and Rossant, 2010).
شکل ‏15: قطبیت رویان موش. در مرحلهی 8 سلولی، همهی بلاستومرها قطبی شده و دو ناحیهی راسی و پایهای را شکل میدهند (Cockburn and Rossant, 2010).
این دو ناحیه از نظر پراکنش اتصالات سلولی، پروتئینهای قطبی، فاکتورهای رونویسی و اسکلت سلولی متفاوت هستند. این تفاوتها مقدمات ایجاد اولین ردههای سلولی را، طی تقسیمهای بعدی، فراهم میکند. به این صورت که، در مرحلهی 8 به 16 سلولی، اگر تقسیم متقارن انجام شود و صفحهی تقسیم، موازی با محور داخلی – خارجی باشد، دو سلول ایجاد شده مشابه با سلول مادری، قطبی بوده و در خارج قرار میگیرند. اما اگر صفحهی تقسیم عمود بر این محور باشد و تقسیم بهطور نامتقارن انجام گیرد، یک سلول قطبی و یک سلول غیر قطبی ایجاد میشود، که سلول قطبی در خارج و سلول غیر قطبی در داخل قرار میگیرد (شکل ‏16). مشابه این تقسیمها، در مرحله 16 به 32 سلولی نیز رخ میدهد. دو جمعیت سلولی ایجاد شده توسط این تقسیمات، سرنوشت تکوینی متفاوتی خواهند داشت (Oron and Ivanova, 2012). بلاستومرهای قطبی که در قسمت خارجی رویان قرار گرفتهاند، ردهی تروفواکتودرم25 را شکل میدهند و بلاستومرهای غیر قطبی، در ایجاد تودهی سلولی داخلی26 شرکت میکنند (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏16: تقسیم مرحلهی 8 به 16 سلولی. تقسیم متقارن دو سلول قطبی و تقسیم نا متقارن یک سلول قطبی و یک سلول غیر قطبی ایجاد میکند (Cockburn and Rossant, 2010).
با ورود به مرحلهی 32 سلولی و ایجاد ردهی تروفواکتودرم، حفرهی پر از مایعی به نام بلاستوسل27 شروع به شکلگیری میکند. حضور حفرهی بلاستوسل، برای تکوین صحیح توده سلولی داخلی، ضروری است (شکل ‏17). تشکیل این حفره، وابسته به عملکرد پمپ Na+/K+ است که در سمت پایهای سلولهای تروفواکتودرم قرار گرفته و با ایجاد شیب غلظت سدیم، باعث ورود آب به درون رویان میشود. در این میان، اتصالات محکم28 بین سلولهای تروفواکتودرم، به حفظ حفره کمک میکند و مانع جابجایی مایع بلاستوسل و یونهای سدیم، در دو طرف این سلولها میشود (Kidder and Watson, 2005, Cockburn and Rossant, 2010) (شکل ‏18).
شکل ‏17: تشکیل حفرهی بلاستوسل و رانده شدن توده سلولی داخلی به یک سمت از رویان (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏18: آرایش سیستمهای انتقالی29 در سلولهای تروفواکتودرم که توسط اتصالات محکم و سوراخدار30 به یکدیگر متصل شدهاند. پمپ Na+/K+ با همکاری کانالها و ناقلین یونی، موجب تجمع Na+ در سمت پایهای سلولها میشود. این حالت، جریان یافتن آب به درون سلولهای تروفواکتودرم و سپس به فضای خارج سلولی سمت پایهای را از طریق کانالهای آبی آکوآپورین31 موجب میشود (Kidder and Watson, 2005).
رویان 5/3 روزه که شامل حفرهی بلاستوسل و دو رده سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی است، بلاستوسیست32 نامیده میشود. در این مرحله، توده سلولی داخلی که به دلیل گسترش حفرهی بلاستوسل، به یک سمت رویان رانده شده، تمایز دو ردهی اپیبلاست33 و اندودرم اولیه34 را آغاز میکند. سلولهای متمایز شده به اندودرم اولیه در سطح توده سلولی، یعنی جایی که با حفره در ارتباط است، قرار میگیرند. در حالی که سلولهای پرتوان اپیبلاست، بخش زیرین، یعنی بین لایهی تروفواکتودرم و اندودرم اولیه را شامل میشوند. پس از ایجاد این سه رده در روز 5/4، بلاستوسیست کامل شده و آمادهی لانهگزینی در دیوارهی رحم میگردد (Oron and Ivanova, 2012). تا این مرحله، غشای شفاف همچنان رویان را احاطه کرده و از آن حفاظت میکند. اما قبل از لانهگزینی، برای اینکه رویان بتواند بهطور مستقیم با دیوارهی رحم ارتباط برقرار کند، باید از این غشا خارج شود. به این فرایند خروج از زونا35 گفته میشود که با نازک شدن غشا، به دلیل رشد بلاستوسیست و ترشح برخی آنزیمها و در نهایت شکافته شدن آن همراه است (شکل ‏19) (Montag et al., 2000).
پس از لانهگزینی، هر کدام از این ردههای سلولی، مسیر تکوینی متفاوتی پیش خواهند گرفت. حضور رده ترفواکتودرم، برای لانهگزینی و الگوبندی رویان36 ضروری است. این رده در نهایت جفت37 را تشکیل میدهد. رده سلولی اندودرم اولیه، نقش مهمی در تکوین محور خلفی- قدامی دارد و نهایتا کیسه زرده38 را میسازد. سلولهای اپیبلاست نیز، رویان کامل را شکل میدهند (شکل ‏19) (Oron and Ivanova, 2012, Yamanaka et al., 2006).
شکل ‏19: بلاستوسیست در حال خروج از زونا (1)، که شامل سه رده سلولی تروفواکتودرم (2)، اپیبلاست (3)، اندودرم اولیه (4) و همچنین حفرهی بلاستوسل (5) میباشد (Lopata et al., 1983).
1-1-3 مکانیسمهای مولکولی دخیل در لایهزایی رویان
یکی از ویژگیهای منحصر به فرد تکوین پیش از لانهگزینی پستانداران، تنظیم بسیار دقیق وقایع آن است. این ویژگی، در جدایی ردههای سلولی، که تغییرات مورفولوژیکی با مکانیسمهای مولکولی همراه شده، بسیار پررنگ است.
1-1-3-1 جدایی دو ردهی سلولی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی
طی تکوین ابتدایی رویان موش، اولین ردهی سلولی که ایجاد میشود، تروفواکتودرم است که از تودهی سلولی داخلی متمایز میگردد. جدا شدن این دو ردهی سلولی، توسط گروه کوچکی از فاکتورهای رونویسی کنترل میشود. مطالعه بر روی رویان و سلولهای بنیادی نشان داده است که ایجاد و حفظ ردهی سلولی تروفواکتودرم وابسته به عملکرد فاکتورهای رونویسی مانندTead439، Cdx240 و 41Eomes است. از طرف دیگر، عوامل رونویسی همچون 42Oct4، Nanog و 43Sox2 وظیفهی حفظ پرتوانی44 توده سلولی داخلی را دارند. ژنهای پرتوانی، توسط Cdx2 که پاییندست Tead4 قرار گرفته است، سرکوب میشوند. از آنجایی که مسیر پیامرسان Hippo، بیان این فاکتور رونویسی را به سلولهای خارجی (سلولهای تروفواکتودرم آینده)، محدود میکند (شکل ‏110)، فاکتورهای پرتوانی نیز، محدود به توده سلولی داخلی میشوند. بنابراین، تمایز دو ردهی تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی، از تفاوت بیان این دو گروه ژن در بلاستومرهای رویان، نشأت میگیرد (Cockburn and Rossant, 2010, Strumpf et al., 2005).
شکل ‏110: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. اتصالات سلولی بلاستومرهای داخلی، موجب راه اندازی مسیر پیام رسان Hipoo، غیرفعال شدن Tead4 و بنابراین سرکوب Cdx2 میشود. در سلولهای خارجی، غیرفعال ماندن این مسیر، رونویسی از ژن Cdx2 را در پی دارد (Cockburn and Rossant, 2010).
1-1-3-2 جدایی دو ردهی سلولی اپیبلاست و اندودرم اولیه
جدایی این دو ردهی سلولی، بیش از آنکه با موقعیت سلولها در ارتباط باشد، به بیان عوامل رونویسی وابسته است. بهطور کلی، وقایع این دوره را میتوان در سه مرحله خلاصه کرد (شکل ‏111). ابتدا، عوامل رونویسی اختصاصی دو رده، به شکل یکنواخت و همراه با هم در توده سلولی داخلی بیان میشوند (پیرامون مرحلهی 32 سلولی). در ادامه، این دو گروه عامل رونویسی، بصورت ناسازگار با هم و مستقل از موقعیت سلول، در تودهی داخلی توزیع میگردند. به این الگوی توزیع، اصطلاحا “نمک و فلفل45” گفته میشود (پیرامون مرحلهی 64 سلولی). نهایتا، با حرکت سلولها به موقعیت مناسب خود، جدایی فضایی ومکانی دو رده نیز رخ میدهد (پیرامون مرحلهی 100 سلولی) (Xenopoulos et al., 2012).
شکل ‏111: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپیبلاست در سه مرحله (Xenopoulos et al., 2012).
یکی از مسیرهای انتقال پیام دخیل در این ردهزایی، مسیر FGF46/MAPK است که فعال شدن آن موجب القای بیان عوامل رونویسی اختصاصی اندودرم اولیه، مانند 47Gata6 میشود. Gata6 مانند 5 عضو دیگر خانوادهی GATA، دارای موتیف انگشت روی48 و همچنین قدرت اتصال به توالی (A/G) GATA (A/T) است.
گیرندهی این مسیر Fgfr2، لیگاند آن Fgf4 و پروتئین تطبیق دهندهی آن، Grb249 است. در مقابل، عوامل پرتوانی قرار گرفتهاند که سلولهای تودهی داخلی را به سمت اپیبلاست سوق میدهند و موجب حفظ خاصیت پرتوانی این سلولها میشوند. یکی از این عوامل رونویسی Nanog است که در مرحلهی 64 سلولی، بیان آن با Gata6 ناسازگار میشود. بنابراین سلولهایی که مسیر انتقال پیام FGF/MAPK در آنها فعال باشد، با بیان Gata6 و مهار Nanog به سمت اندودرم اولیه متمایز میشوند و بالعکس، سلولهایی با مسیر انتقال پیام غیرفعال، ردهی اپیبلاست را تشکیل میدهند (شکل ‏112). جهش در ژن Grb2 موجب اختلال در مسیر FGF/MAPK و عدم شکلگیری اندودرم اولیه میشود. اما در مورد رویانهایی که از نظر Gata6جهش یافتهاند، اندودرم اولیه شروع به شکلگیری میکند ولی بعد از لانهگزینی، اندودرم احشایی50 ایجاد نمیشود (Chazaud et al., 2006, Patient and McGhee, 2002).
قابل ذکر است که پس از مشخص شدن سرنوشت بلاستومرها توسط تنظیمات مولکولی، بازیابی مکانی این دو گروه سلول، تحت اثر نوع اتصالات و همچنین پیامهایی که از طرف حفرهی بلاستوسل و سلولهای تروفواکتودرم فرستاده میشوند، انجام میپذیرد. سلول پیشساز اندودرم اولیهای که در عمق قرار گرفته است اگر موفق به جابجایی نشود، توسط مرگ برنامهریزی شده از بین میرود و یا اینکه به سلول پرتوان اپیبلاست تبدیل میشود (Oron and Ivanova, 2012).
شکل ‏112: دخالت مسیر پیام رسان FGF/MAPK در جدایی دو ردهی اندودرم اولیه و اپیبلاست. بازیابی مکانی این دو رده در روز 5/4 کامل میشود (Chazaud et al., 2006).
1-2 تکنیکهای کمک باروری
یکی از ویژگیهای رویان در مراحل قبل از لانهگزینی، توانایی تکوین آن در محیطهای کشت ساخته شده توسط بشر است. این انعطاف پذیری، در توسعه تکنیکهای کمک باروری که امروزه به دلیل افزایش ناباروری از اهمیت قابل توجهی برخوردار هستند، کمک شایانی کرده است (Cockburn and Rossant, 2010).
1-2-1 لقاح آزمایشگاهی51
لقاح آزمایشگاهی، یکی از تکنیکهای کمک باروری است، که به دلایل مختلفی همچون انسداد لولههای رحم، تعداد کم اسپرم و چسبندگیهای حفرهی لگنی مورد استفاده قرار میگیرد (Squires and Kaplan, 2007). تا کنون این تکنیک، در بیش از 20 گونه از پستانداران صورت گرفته است. اولین بارداری موفق که منجر به تولد یک پستاندار زنده شد، توسط Chang در سال 1959 و بر روی خرگوش صورت پذیرفت (Chang, 1959). در سال 1968 نیز، برای نخستین بار رویانهای موش حاصل از لقاح آزمایشگاهی متولد شدند (Whittingham, 1968). سرانجام اولین نوزاد انسان حاصل از IVF با همکاری Patrick Steptoe و Robert Edwards در 25 جولای 1978 به دنیا آمد (Steptoe and Edwards, 1978).
به طور کلی، طی فرایند IVF، تخمک بالغ با اسپرم ظرفیتپذیر شده، تحت شرایط خاص آزمایشگاهی از جمله میزان کنترل شده O2، CO2، رطوبت و دما لقاح داده میشوند. یک لقاح موفقیتآمیز، تا حدودی وابسته به ترکیبات محیط مورد استفاده در این فرایند است. اساس محیطهای پرکاربرد در این زمینه، محیطی به نام مایع لولهی رحمی انسان52 است که در سال 1985 به عنوان اولین محیط تخصصی لقاح آزمایشگاهی توسط Quinn فرمولبندی شد (جدول ‏11) (Quinn et al., 1985).
جدول ‏11: ترکیبات محیط HTF ساخته شده توسط Quinn (Quinn et al., 1985).
mMComponent101.6NaCl4.69KCl0.20MgSO4 . 7H2O0.37KH2PO42.04CaCl2 . 2H2O25NaHCO32.78Glucose0.33Na pyruvate21.4Na lactate100 U/mlPenicillin50 µg/mlStreptomycin SO40.001% (w/v)Phenol red
1-2-1-1 کیفیت سلول تخم
یکی از چالشهایی که در لقاح آزمایشگاهی وجود دارد، کاهش دادن تعداد رویانهای انتقالی، بدون پایین آمدن شانس باروری است. اولین قدم در این مسیر، انتخاب سلولهای تخم سالم و مناسب است. کیفیت سلول تخم را میتوان از طریق بررسی تعداد، سایز و موقعیت پیش هستهها در آن، اجسام قطبی و کیفیت سیتوپلاسم ارزیابی کرد. یک تخمک لقاح یافتهی نرمال، دارای دو پیش هسته و دو جسم قطبی میباشد. اما پیش هستهها همواره به راحتی قابل مشاهده نیستند. در این صورت با مشاهدهی دو جسم قطبی، آن را سلول تخم در نظر میگیریم. پیش هستههای نر و ماده بسیار به یکدیگر نزدیک و معمولا همسایز یا با اختلاف خیلی جزئی تفاوت سایز دارند. سیتوپلاسم با کیفیت نیز، بدون واکوئل و یکنواخت میباشد (Lundin et al., 2001, Balaban et al., 2004).
1-2-2 کشت آزمایشگاهی رویان53
کشت آزمایشگاهی سلولهای تخم حاصل از لقاح خارج رحمی، راهکاری دیگر در راستای افزایش نرخ باروری است. رشد سلول تخم، در محیط کشت و بررسی گذر آن از مراحل اولیهی تکوین، به انتخاب رویان مناسب، جهت انتقال به رحم کمک میکند.
در این رابطه، مرحلهی بلاستوسیست بسیار حائز اهمیت است زیرا رویان در این مرحله، دارای ژنوم فعال شده و پتانسیل تکوینی بالاتری نسبت به مراحل قبلی از خود نشان میدهد. بهعلاوه، با بررسی ویژگیهای مورفولوژیکی آن، میتوان موفقیت در لانهگزینی را تا حدودی پیشبینی و بنابراین رویان مناسبتری را جهت انتقال به رحم انتخاب کرد. به این شکل بدون کاهش نرخ باروری میتوان تعداد رویانهای انتقالی را کاهش داد (Wittemer et al., 2000, Kovačič and Vlaisavljević, 2012).
قابل ذکر است که ارزیابی مورفولوژیکی بلاستوسیستها، با بررسی نسبت حجم حفرهی بلاستوسل به کل رویان، حجم توده سلولی داخلی و انسجام سلولهای ترفواکتودرم انجام میپذیرد. در این راستا معیارهای دیگری مانند درجهی تکه تکه شدن54، ضخامت زونا، چند هستهای بودن بلاستومرها و نسبت تعداد سلولهای تودهی داخلی به کل سلولها نیز، مورد توجه قرار میگیرد (Kovačič and Vlaisavljević, 2012).
هرچند انعطاف پذیری بالای رویان پستانداران، در مواجه با شرایط برونتنی55 باعث زندهمانی آنها در محیطهای کشت شده است، اما هنوز نرخ زندهمانی و کیفیت رویانها در این حالت نسب به حالت درونتنی56 پایینتر میباشد. به همین دلیل تلاشهای بسیاری در جهت بهبود این محیطها صورت پذیرفته است. اولین محیط تخصصی کشت رویان (شامل 9 ترکیب) در سال 1956 توسط Whitten ساخته و رشد رویان 8 سلولی موش تا مرحلهی بلاستوسیست در این محیط گزارش شد. مطالعات بعدی توسط Biggers (Biggers et al., 1967) نشان داد که تکوین سلول تخم موش تا مرحلهی دو سلولی، وابسته به حضور پیروات در محیط کشت است (Summers and Biggers, 2003). از آنجایی که رویان تا مرحلهی 8 سلولی به جای گلوکز، از پیروات و لاکتات به عنوان منبع انرژی استفاده میکند و حضور گلوکز در محیطهای ساده موجب تاخیر یا توقف در تکوین میشود، محیط کشت CZB در سال 1989 توسط Chatot روی کار آمد. این محیط که حاوی EDTA57، میزان افزایش یافتهی پیروات، لاکتات و همچنین گلوتامین جایگزین گلوکز بود ، موجب گذر رویان برخی نژادهای موش، از توقف موجود در مرحلهی دو سلولی و رشد آنها تا مرحلهی بلاستوسیست شد (Chatot et al., 1989). در سال 1992 محیط کشت SOM58 توسط Lawitts و Biggers ساخته شد که بعدها پس از افزایش غلظت NaCl و KCl،KSOM59 نام گرفت (جدول ‏12).
این محیط، رشد سلول تخم تا مرحلهی بلاستوسیست را بهتر از محیطهای قبلی حمایت میکند و تا به امروز یکی از پرکاربردترین محیطها در زمینهی کشت رویان موش به حساب میآید (Lawitts and Biggers, 1993).
جدول ‏12: ترکیبات محیط KSOM ساخته شده توسط Lawitts و Biggers (Lawitts and Biggers, 1993).
Concentration
gr/literComponent5.55NaCl0.186KCl0.0476KH2PO40.0493MgSO41.87Lactate0.022Pyruvate 0.036Glucose0.146Glutamine 1BSA0.0038EDTA2.10NaHCO30.251CaCl2 . 2H2O
1-2-3 انجماد60
یکی از پیشرفتهای تکنیکهای کمک باروری در دهههای اخیر، انجماد است. این تکنیک در مواردی که تعداد رویانهای حاصل از لقاح آزمایشگاهی، بیش از تعداد مورد نیاز جهت انتقال به رحم باشد، مورد استفاده قرار میگیرد. در این حالت اگر دورهی درمانی با شکست مواجه شود، میتوان از رویانهای منجمد شده، در دورههای بعدی استفاده گردد و احتیاجی به تکرار کامل مراحل درمانی نمیباشد. انجماد همچنین برای حفظ تخمک خانمهایی که فعالیت تخمدان آنها به دلایل مختلف مانند بیماریهای لگنی و درمانهای کلینیکی همچون شیمی درمانی کاهش مییابد و یا تخمکهای آنها آسیب میبیند، مناسب میباشد (Porcu et al., 1997, Tucker et al., 1998).
1-2-3-1 اصول انجماد
سلولهای زنده، به منظور ذخیرهی طولانی مدت، باید به حالتی از حیات معلق61 درآیند که با گذشت مدت زمان نامعلوم، قابلیت بازگشت به حالت طبیعی و ادامهی حیات را داشته باشند. به این منظور، از دماهای پایین استفاده میشود. به طور کلی دمایی که برای ذخیرهی سلولهای پستانداران استفاده میشود، شC 196- (دمای نیتروژن مایع) است که به نظر میرسد برای این هدف کافی باشد. زیرا در این دما، آب تنها به حالت جامد وجود دارد و هیچ گونه واکنش بیولوژیک شناخته شدهای رخ نمیدهد (Mazur, 1980). از آنجایی که رویان پستانداران در دمای C37 زنده میماند و هیچ فعالیت بیولوژیکی در دمای مC 196- اتفاق نمیافتد، محدودهی خطرناک برای رویان در طول فرایند انجماد، طی انتقال دما میباشد. یعنی در طول سرد شدن تا دمای بC 196- و در طول فرایند گرم شدن62 دوباره تا دمای C 37. هنگامی که آب به زیر نقطهی انجماد سرد میشود، ساختار جامد کریستالی ایجاد میکند که به عنوان یخ شناخته میشود. از آنجا که تراکم یخ از آب مایع کمتر است، بنابراین حجم بیشتری نسبت به آب مایع اشغال میکند و منجر به ایجاد فشار و نیروهای شکننده روی اندامکهای درون سلولی میشود. بنابراین پیشگیری از تشکیل کریستال یخ، یکی از رموز اصلی در انجماد موفق است (Mazur, 1963). وقتی آب مایع به یخ تبدیل میشود، هر مادهی محلول در فاز مایع از قسمت جامد جدا میماند. این مواد، نقطه انجماد محلول باقی مانده و منجمد نشده را پایین میآورند. با ادامهی این فرایند، غلظت الکترولیتها و سایر مواد حل شده به سطوح بالایی میرسد که میتواند برای پروتئینهای داخل سلولی سمی باشد. بنابراین پیشگیری از اثر محلول63، دومین نکتهی کلیدی در انجماد موفق است (Lovelock, 1954). در طول فرایند گرم کردن، ذوب شدن یخ جامد و رها شدن آب آزاد، منجر به کاهش اسمولاریته محلول اطراف آن میشود. اگر فرایند گرم شدن، آهسته باشد، خطر اینکه آب آزاد دوباره به کریستال تبدیل شود زیاد است، که این امر آسیبهای بعدی را ایجاد میکند و در صورتی که این فرایند سریع انجام شود، فشار اسمزی ایجاد شده ممکن است منجر به انتقال ناگهانی آب از طریق غشا به داخل سلول و در نتیجه تورم و آسیب به سلول گردد (Mazur, 1980). این پدیده، شوک اسمزی نام دارد و پیشگیری از آن، سومین رمز انجماد موفق است. بنابراین فقط فرو بردن سلول یا رویان، درون نیتروژن مایع، منجر به موفقیت در انجماد نمیشود و سه اصل ذکر شده در بالا باید رعایت گردد. به همین جهت، در تمامی روشهای انجماد، از مواد شیمیایی خاصی به نام عوامل سرما محافظ64 استفاده میشود (Meryman, 2007).
1-2-3-2 مواد سرما محافظ
مواد سرما محافظ، ترکیبات شیمیایی محلول در آب هستند که در انجماد، به عنوان ضدیخ مورد استفاده قرار میگیرند و موجب افزایش نرخ زندهمانی سلولها طی این فرایند میشوند. این مواد را میتوان در دو گروه نفوذپذیر65 یا داخل سلولی66 و نفوذناپذیر67 یا خارج سلولی68 دستهبندی کرد (Jain and Paulson, 2006).
مواد سرما محافظ نفوذناپذیر، که اولین بار توسط Kasai و همکارانش (Kasai et al., 1981) مورد استفاده قرار گرفنتد، اغلب ملکولهای قندی بزرگی هستند که قابلیت ورود به سلول را ندارند. در طی فرایند انجماد، این مواد با ایجاد شیب اسمزی، آب داخل سلول را به بیرون میکشند و موجب چروکیدگی سلول میگردند. هرچند کاهش آب داخل سلول، موجب کاهش تشکیل کریستالهای یخ میشود، اما باید توجه کرد که خروج آب سلول به مقدار زیاد، باعث افزایش غلظت ترکیبات داخل سلولی و ایجاد اثر محلول میشود که این حالت برای سلول کشنده است. برای تعدیل این اثر، میتوان در محیطهای انجمادی از عوامل سرما محافظ نفوذپذیر استفاده نمود. ضدیخهای نفوذپذیر، ملکولهای کوچکی هستند که به آسانی و به سرعت از غشای سلول عبور میکنند. بنابراین با ورود به سلول، موجب حفظ اسمولاریتی داخل سلولی و بازگشت مقداری از آب خارج شده به سلول میشوند (Fasano, 2013). علاوهبراین، با قرارگیری بین ملکولهای آب و افزایش گرانروی69، حرکت ملکولهای آب را کاهش میدهند و در نقطهی انجماد، به دلیل اتصالی که با این ملکولها ایجاد کردند، مانع تشکیل کریستال یخ میشوند (Nash, 1962).
در فرایند ذوب، ضدیخهای نفوذ ناپذیر نقش بسیار مهمی دارند. استفاده از این مواد در محیطهای ذوب و بنابراین حضورشان در فضای خارج سلولی، از ورود ناگهانی آب به داخل سلول و ایجاد شوک اسمزی جلوگیری میکند (Schneider and Mazur, 1984). بنابراین برای افزایش بازده فرایند انجماد-ذوب، باید ترکیبی از هر دو گروه ضدیخ استفاده شود.
از ضدیخهای نفوذناپذیر میتوان به ساکاریدهایی همچون ساکارز70، ترهالوز71 و ماکروملکولهایی مانند پلی وینیل الکل72 و پلی وینیل پیرولیدون73 اشاره کرد. اتیلنگلیکول74، گلیسرول75 و دی متیل سولفوکسید76 نیز، از جمله ضدیخهای نفوذپذیر پرکاربرد هستند (Fasano, 2013). از آنجایی که برخی ضدیخها برای سلول سمی هستند و نمیتوان غلظتهای بالایی از آنها را مورد استفاده قرار داد، بهتر است از ترکیب چند ضدیخ با غلظت پایینتر استفاده نمود. به این ترتیب میتوان تاثیرات سمی غلظتهای بالای هریک از آنها را کاهش داد. به این عمل، خنثیسازی سمیت مواد سرما محافظ77 میگویند (Tucker and Liebermann, 2007). علاوه بر این مشاهده شده است که نفوذ پذیری ترکیبی از چند ضدیخ، نسبت به نفوذپذیری هریک از آنها به تنهایی، به طور معنی داری بالاتر است (Vicente and Garcia-Ximenez, 1994).
1-2-3-3 روشهای انجماد
جهت حفظ و ذخیرهی سلول و رویان، دو روش انجماد آهسته78 و انجماد شیشهای79، مورد استفاده قرار میگیرند. این دو روش از نظر نحوهی ذخیره، ذوب و آبدهی تا حدودی مشابه ولی از نظر غلظت ضدیخهای مورد استفاده و مرحلهی انجماد کاملا متفاوت میباشند (Karlsson, 2002).
1-2-3-3-1 انجماد آهسته
اساس این روش، کاهش دما به صورت آهسته و کنترل شده تا C 196- میباشد که به این منظور از یک دستگاه فریزر قابل برنامهریزی80 استفاده میشود. در انجماد آهسته، نمونه پس از متعادلسازی در محیطی با غلظت پایین مواد سرما محافظ، درون نی پلاستیکی مخصوص قرار گرفته و طی چند مرحله سرد میشود.
سرعت سرد شدن نمونه طی این فرایند، ابتدا سC/min 2- و در ادامه C/min 3/0- تا 6/0- میباشد. با رسیدن دما به محدودهی یC 30- تا 60-، نی حاوی نمونه درون ازت مایع برده شده و نگهداری میشود (Cutting et al., 2009).
انجماد آهسته برای اولین بار در سال 1972 بر روی رویان موش انجام گرفت و نوزاد حاصل از انتقال مرولای منجمد-ذوب شده متولد گردید (Whittingham et al., 1972). مطالعات بعدی، منجر به بهبود و توسعهی این تکنیک و ورود آن به حوزهی انسانی شد. به طوریکه در سال 1983، اولین بارداری موفقیت آمیز در مورد انتقال رویان انسانی منجمد-ذوب شده اعلام گردید (Trounson and Mohr, 1983). علیرغم پیشرفتهایی که در انجماد آهسته صورت گرفته است، امروزه این روش در زمینهی انجماد سلول و رویان کاربرد زیادی ندارد. زیرا انجماد آهسته، علاوه بر این که روشی زمانبر و گران قیمت است، برای انواع سلولها و رویانها نیز مناسب نمیباشد. همچنین با وجود این که نمونه با سرعت کمی از ناحیهی خطر عبور کرده و مجال جابجایی محلول، بین محیط خارج و داخل سلول مهیا است و شوک اسمزی شدیدی رخ نمیدهد، به نظر میرسد غلظت پایین مواد سرما محافظ مورد استفاده، برای ممانعت از تشکیل کریستال یخ کافی نیست. این امر در نهایت منجر به آسیب سلولی خواهد شد (Vajta and Kuwayama, 2006). بنابراین برای برطرف کردن نواقص این روش، انجماد شیشهای بر پایهی دو اصل، غلظت زیاد مواد سرما محافظ و سرعت بالای سرمادهی81 و گرمادهی82 روی کار آمد.
1-2-3-3-2 انجماد شیشهای
انجماد شیشهای، به معنی انجماد محلول، بدون تشکیل کریستال یخ (شکل ‏113) در دمای پایین میباشد، که این امر با افزایش غلظت مواد سرما محافظ و نرخ سرمادهی بالا امکان پذیر است. به طور خلاصه، در این روش ابتدا رویانها در یک محلول حاوی عوامل سرما محافظ با غلظت پایین قرار میگیرند که منجر به از دست دادن آب و نفوذ ضدیخ به درون سلولها میشود، در مرحلهی بعد رویانها به مدت خیلی کوتاه (حدود یک دقیقه) درون غلظت بالاتری از ضدیخ قرار گرفته و در ادامه توسط حاملهای انجماد، به درون ازت مایع منتقل میشوند. بنابراین در این روش، نمونه با سرعت زیادی ( C/min 30000-15000) از ناحیهی خطر عبور کرده و به یکباره تا دمای C 196- سرد میشود. فرایند ذوب نیز با سرعت و به کمک رقیقسازی محلولهای حاوی ساکارز انجام میگیرد (Mukaida and Oka, 2012).
شکل ‏113: فرایند شیشهای شدن محیط انجماد در حضور مواد سرما محافظ طی انجماد شیشهای (Liebermann et al., 2003).
در این نوع انجماد، مدت زمان انجام فرایند کم است و نیازی به تجهیزات پیچیده و گران قیمت نمیباشد. همچنین، با استفاده از غلظتهای بالای مواد سرما محافظ، آسیبهای ناشی از کریستال یخ، کاهش یافته است. برای مقابله با اثرات سمی ضدیخ نیز، علاوه بر استفاده از ترکیب چند نوع مادهی سرما محافظ با غلظتی مناسب، نمونه مدت زمان کمتری در مجاورت با این عوامل قرار میگیرد (Vajta and Kuwayama, 2006). با توجه به این مزیتها، تکنیک انجماد شیشهای که برای اولین بار، در سال 1937 توسط Luyet و همکارانش مطرح گردید (Luyet, 1937)، به تدریج در زمینهی حفظ رویانهای حیوانی و انسانی جایگزین انجماد آهسته شد.
چند سال پس از مطرح شدن ایدهی انجماد شیشهای، این روش با موفقیت بر روی رویان 4 سلولی موش انجام شد و نرخ زندهمانی بهتری نسبت به انجماد آهسته بدست آمد (Rall and Fahy, 1985). در ادامهی این روند تکاملی، گزارشی مبنی بر انجماد رویان 8 سلولی موش توسط Rall و همکارانش منتشر گردید (Rall et al., 1987) و سرانجام در سال 2000 اولین حاملگی و تولد بعد از انتقال بلاستوسیست انسانی منجمد-ذوب شده به این روش و با استفاده از دی متیل سولفوکسید و اتیلنگلیکول گزارش شد (Yokota et al., 2000).
با در نظر گرفتن مزایای ذکر شده در بخش 1-2-2، در مورد برتری انتقال بلاستوسیست نسبت به سایر مراحل رویان، انجماد موفقیت آمیز رویان در این مرحله، بسیار حائز اهمیت میشود. با توجه به کوچک شدن اندازهی بلاستومرها و کاهش میزان آب درون سلولی طی فرایند تسهیم، انتظار میرفت میزان زندهمانی بلاستوسیستهای ذوب شده بیشتر از مراحل قبلی باشد. اما نتایج نشان دهندهی نرخ زندهمانی پایینتر بلاستوسیست ذوب شده بود. دلیل این مسئله را میتوان در حفرهی پر از مایع بلاستوسل جستجو کرد. وجود



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید