تعیین بهترین مرحله پیشرفت جنینی در برابرتاثیرات DMSO و EG به عنوان مواد محافظ انجماد شیشه ای بر روی کیفیت مراحل مختلف شکافتگی در جنین های موش سوری.
چکیده
مقدمه: روش های گوناگونی برای نگهداری تخمک ها و جنین های پستانداران تا کنون گزارش شده است. انجماد شیشه ای یک روش سازگار با بدن موجود زنده با مزیت اصلی جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ که علت اصلی آسیب سلولی در روش های انجماد با سرعت پایین است، می باشد.طبق گزارشات به چاپ رسیده قبلی در زمینه انجماد شیشه ای فوق سریع، این نوع انجماد بر اساس افزیش سرعت های سرمایش و گرمایش می باشد. این روش ها باعث کاهش مدت زمانی می شوند که سلول ها در برابر مواد محافظ در دمای غیر انجمادی قرار می گیرند و ضمنا باعث کاهش میزان سمیت تخمک ها و جنین ها و همچنین باعث کاهش آسیب سلول در برابر انجماد می شوند.
هدف: تعیین بهترین مرحله پیشرفت جنینی در برابرتاثیرات DMSO و EG به عنوان مواد محافظ انجماد شیشه ای بر روی کیفیت مراحل مختلف شکافتگی در جنین های موش سوری.
مواد وروش ها: محلول های انجماد شیشه ای از DMSO، EG، HAS و Hams,F10 به همراه سوکروز تهیه شدند. محلول کشت از محلول HTF که حاوی BSA بود تهیه گردید. محیط های ذوب با استفاده از سوکروز در محلول HTF حاوی 10 درصد آلبومین به دست آمد. موش های ماده بالغ نژاد NMRI، 6 تا 10 هفته ای تحت سوپر اوولاسیون القایی با استفاده از تزریقات 5/7 واحد از PMSG و 5/7 واحد از HCG بعد از 48 ساعت از اولین تزریق قرار گرفتند. تخمک های بارور نشده از موش های ماده و اسپرم ها از موش های نر توسط قطع نخاع پس از 13 ساعت از تزریق HCG جمع آوری شدند. پس از IVF، در محیط های کشت، جنین ها در مراحل مختلف رشد با استفاده از محیط های انجمادی در استراهای پلاستیکی به روش Open Pull طبق روش Kasai منجمد شدند. پس از دو هفته نگهداری جنین ها در نیتروژن مایع، دوباره در محیط آزمایشگاهی ذوب و کشت شدند.
نتایج: در این تحقیق پس از ذوب 466 جنین منجمد شده، اکثریت آنها از نظر شکل ظاهری، ریخت طبیعی داشتند. سرعت شکافتگی در راستای رسیدن به مرحله ی بلاستوسیست مرتبط با سرعت رشد جنین ها بود. نتایج نشانگر آنست که مراحل رشد بالاتر نسبت به مراحل زیگوت و دو سلولی نتایج بهتری را حاصل نمودند.
نتیجه گیری: مرحله مورولا بهترین مرحله برای جنین های موش محسوب می شود، زیرا که سرعت احیای مورولای منجمد شده 97 درصد بوده که با ریخت شناسی و یا نمو تا مرحله بلاستولایی تایید می شود.
کلمات کلیدی: انجماد شیشه ای، بلاستوسیست، مورولا، اتیلن گلیکول، دی متیل سولفوکساید
فصل اول
مقدمه
1- مقدمه
بشر از قرنها قبل با پدیده یخ زدن و کاربردهای آن در زندگی و فواید و مضرات احتمالی آن آشنا بوده است. مشاهده دانه های گیاهان که علیرغم گذرانیدن فصل یخبندان پس از گرم شدن هوا و آب شدن یخها و بدنبال قرار گرفتن در خاک مناسب شروع به رویش می کردند این فکر را قوت می بخشید که برخی از جانداران در شرایط مناسب می توانند یخ زدنهای طولانی را تحمل کرده و زنده بمانند. این قبیل مشاهدات بشر را راهنمایی می کرد تا از سرد کردن و یخ زدن برای نگهداری مواد خوراکی استفاده کنند. با پیشرفت دانش بشری روش های گوناگونی برای سرد کردن و نگهداری مواد ابداع شد و هم اکنون انسان از پدیده انجماد تقریبا بطور روزمره استفاده می کند ولی سالهای زیادی از سرما تنها برای نگهداری مواد خوراکی مانند گوشت، ماهی، حبوبات و … استفاده می شد و با توجه به اینکه زنده ماندن این مواد پس از انجماد چندان مورد نظر استفاده کنندگان نبود دانش زیست شناسی انجمادی1 چندان پیشرفت نکرده بود. بتدریج فکر استفاده از سرما برای نگهداری طولانی مدت سیستم های زنده مانند گلبولهای قرمز، مخمرها و … و استفاده از آنها در زمان دیگری قوت گرفت و آزمایشات فراوانی در این رابطه طراحی و انجام شد ولی اکثر این آزمایشات با توجه به عدم موفقیت و یا موفقیت اندکی همراه بود. پراکندگی جمعیت، ناباروری و افزایش حساسیت به بیماریها منجر به افزایش میزان انقراض و کاهش بازدهی تعدادی از گونه ها می شود (Sunquist et al., 2002; Holt et al., 1999).
به منظور حفظ و جلوگیری از انقراض گونه ها و ذخیره ژنتیکی آنها استفاده از تکنولوژی کمک باروری (ART)2 ابزار با ارزشی در جهت رفع این مشکل می باشد. این تکنولوژی شامل روشهای گسترده ای مانند: لقاح آزمایشگاهی (IVF)3، تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرم(ICSI)4 انتقال جنین(ET)5، انتقال هسته(NT) 6، و حفاظت انجمادی7 جنین، تخمک و اسپرم می باشد.(Comizzoli et al., 2000)
1-1- تولید جنین در شرایط in vivo
1-1-1- لقاح8
لقاح فرآیندی است که در طی آن دو سلول جنسی بالغ (یک اسپرم و یک تخمک) درلوله رحمی در هم آمیخته و یک سلول واحد به نام سلول تخم را تشکیل می دهند. بنابراین تخم یک سلول دیپلوئید تمایز نیافته است که از هم در آمیختن دو گامت هاپلوئید بسیار تخصص عمل یافته تشکیل شده است(Eisenbach & Turkaspa, 1998).
1-1-2- نزدیک شدن گامت ها
در این فرآیند، گامت های نر و ماده به لوله رحمی رسیده و به هم نزدیک می شوند. در زمان مقاربت و یا تلقیح مصنوعی مایع منی در حوالی سرویکس در واژن تخلیه و عبور بعدی اسپرم ها از طریق انقباضات ماهیچه های رحمی تسهیل می شود. در شاخ رحم، اسپرماتوزوآ با مواد ترشح شده از غدد رحمی آمیخته شده و وارد لوله فالوپ می شود. در واقع تحرک اسپرماتوزوا نقش اندکی در فرایند انتقال ایفا می کند.
از آنجا که ابتدای لوله فالوپ باریک است، تعداد اسپرم هایی که می توانند به محل لقاح برسند به گونه ای چشمگیر کاهش می یابند. اووسیت بلوغ یافته و یا در حال بلوغ با جنبش انتهای شرابه دار اینفاندیبولوم9 و نیز زنش های مژکی و انقباضات موزون ساختار ماهیچه ای لوله رحمی، از تخمدان به سوی محل لقاح، حرکت می کند(Bigler et al., 1997).
1-1-3- آمیختن گامت ها
در زمان لقاح، اووسیت ثانویه حاصل از نخستین تقسیم کاهشی میوز آزاد می شود. اووسیت ثانویه به لوله رحمی رسیده و در تماس با اسپرماتوزوآ قرار می گیرد. در انسان در هر انزال10 نزدیک به 200 تا 300 میلیون اسپرم، آزاد می شود. از این تعداد، نزدیک به 500 اسپرم به محل لقاح رسیده و تنها یک اسپرم پس از گذشتن از سد سلول های تاج شعاعی، زوناپلوسیدا و غشای اووسیت ثانویه به اووسیت می پیوندد.
اتصال سر اسپرم با غشای پلاسمایی اووسیت، هنگامی رخ می دهد که اسپرم بتواند مانع نخست (سلول های تاج شعاعی) را با فعالیت آنزیم هیالورونیداز، مانع دوم (زوناپلوسیدا) را با فعالیت زونالیزین(Zonalysin) و ماده ی شبیه تریپسینی دیگر و مانع سوم (غشای زرده ای) را پشت سر بگذارد. بلافاصله پس از ورود سر اسپرم به درون اووسیت، نقطه ی از هم گسسته ی ورود بر روی ZP با گرانول های سیتوپلاسمی بسته می شود تا از ورود سایر اسپرم ها جلوگیری شود. این فرآیند انسداد زرده11ای نامیده می شود(Florman et al., 1998; Sadler,2006).
1-1-4- نتایج لقاح
1- اووسیت ثانویه، به محض ورود اسپرم دومین تقسیم میوزی (بلوغ) را کامل کرده و هم چنان به دومین گویچه ی قطبی12 را به بیرون از غشای زرده ای (فضای پیرامون زرده ای) می راند، یک تخمک بالغ یا اوول (هاپلوئید) را تشکیل می دهد. هسته ی تخمک بالغ پیش هسته ی ماده13 نامیده می شود. هم زمان، سر اسپرم متورم می شود تا پیش هسته ی نر14 را تشکیل دهد. هر دو پیش هسته، در هم آمیخته و تعداد کروموزوم دیپلوئید، دوباره در سلول تخم برقرار می شود.
2- جنسیت کروموزوم 15تعیین می شود. اگر اسپرم حاوی کروموزوم Xتخمک را بارور کند، جنسیت ماده شده و اگر یک اسپرم حاوی کروموزوم Y تخمک را بارور کند جنسیت نر می شود (Sadler,2006).
3- تشکیل موجودی با ژنتیک جدید
4- فعال شدن سلول تخم و آغاز تقسیم
1-1-5- شکافتگی16
پس از تشکیل تخم، رویان متحمل تقسیمات میتوزی متعدد می شود. سلول تخم در مقایسه با سلول های غیرجنسی بدن دارای نسبت سیتوپلاسم به هسته بیشتری است. طی تقسیماتی که این سلول انجام می دهد این نسبت به تدریج کوچکتر می شود، یعنی از مقدار سیتوپلاسم آن به تدریج کم شده و هسته آن نسبتا بزرگتر می شود. این نوع تقسیمات را کلیواژ می نامند (Solter&Knowles, 1975).
تقسیمات میتوزی رویان را می توان به مراحل مختلف تقسیم کرد. پس از اولین تقسیم، سلول تخم به رویان دو سلولی تبدیل می شود و هر یک از این سلولها که اینک یک بلاستومر17 نامیده می شود مجددا برای چندین بار تقسیم شده، به ترتیب رویان چهار سلولی، هشت سلولی و شانزده سلولی را به وجود می آورند. در هر یک از این مراحل، بلاستومرها به طور همزمان دچار تقسیمات میتوزی می شوند. زمانیکه رویان به مرحله 16-32 سلولی رسید مورولا 18نامیده می شود. در مرحله مورولا، بلاستومرها از حالت کروی خارج می شوند و جداره سلولها در تماس کامل با یکدیگر قرار می گیرند و نهایتا یک توده سلولی کروی شکل را به وجود می اورند، در این مرحله به آن مورولای متراکم19 می گویند. اتصال سلولها به خصوص سلولهایی که در حاشیه ی توده سلولی مورولای متراکم قرار دارند، سبب می شود مایعاتی که وارد سلول شده نتواند به راحتی از آن خاج شود (Alomar et al., 2007) .
هم زمان با انباشته شدن مایع در داخل توده سلولی، سلولها به دو گروه تقسیم می شوند. بخشی از آنها در حاشیه قرار می گیرند و تشکیل کیسه ای به نام تروفکتودرم20 را میدهند. سلولهای تشکیل دهنده این لایه را تروفوبلاستی21 یا سلولهای حاشیه ای می گویند. بقیه ی سلولهای رویان که در داخل کیسه ی تروفکتودرم قرار دارند به تدریج دور یکدیگر تجمع می یابند و تشکیل توده سلولی داخلی22 را می دهند. سلولهای تشکیل دهنده توده سلولی را سلولهای رویانی یا امبریوبلاست23 می نامند. سلولهای رویانی، مسئول ساختن بافت های مختلف بدن نوزاد هستند و سلولهای حاشیه ای نیز پس از تحمل تغییراتی به خارجی ترین لایه پرده های رویانی یعنی لایه ی کوریون24 تبدیل می شوند. ترشحات بلاستومرها در داخل مورولای متراکم جمع شده و حفره های پر از مایعی را تشکیل می دهند. این مایعات در فضایی که در حد فاصل بین توده سلولی و لایه ی تروفکتودرم ایجاد می شود تجمع می یابند. در نتیجه تجمع این مایعات، توده سلولی فشرده شده و به گوشه ای رانده می شود. فضایی را که این مایعات اشغال می کند بلاستوسل25 می نامند. رویان بلاستوسل دار را بلاستوسیست26 یا بلاستولا می نامند (Solter&Knowles, 1975; Alomar et al., 2007) . به تناسب رشد بلاستوسیست، بلاستوسل به تدریج بزرگتر شده و توده سلولی کوچکتر می شود. بر همین اساس مرحله بلاستوسیست را می توان به بلاستوسیست اولیه27 و بلاستوسیست توسعه یافته28 تقسیم نمود. در مرحله بلاستوسیست پیشرفته یا توسعه یافته، بخش اعظم رویان به وسیله بلاستوسل اشغال می شود و توده سلولی تنها گوشه ای از حجم رویان را پر می کند. از این مرحله به بعد افزایش حجم مایع بلاستوسل و رشد توده سلولی به گونه ای است که لایه شفاف نمی تواند آن را تحمل نماید. لذا لایه شفاف به تدریج نازکتر شده و نهایتا پاره می شود. پس از پاره شدن آن، رویان که اینک شامل توده سلولی، لایه حاشیه ای و حفره بلاستوسل است، از لایه شفاف خارج شده، پس از آن می تواند به راحتی افزایش حجم یابد. رویان را در این مرحله بلاستوسیست آزاد29 (بلاستوسیست از پوست در آمده یا هچ شده) می گویند(Solter&Knowles, 1975; Alomar et al., 2007).
1-2- تولید جنین در شرایط In vitro
اولین نوزاد متولد شده با استفاده از روش درمانی IVF30 در سال 1978 به وسیله Edwards و Steptoe گزارش شد. این روش درمانی امید تازه ای برای زوج های نابارور به وجود آورد. در آستانه قرن 21 انقلابی در زمینه استفاده از روش های بیوتکنولوژیک در مورد حیوانات اهلی صورت گرفت. این تحولات با تولید موش های ترانس ژنیک31 توسط Brinster و همکاران آغاز گردید و پس از آن به سرعت با تولید گاو، گوسفند و خوک های ترانس ژنیک (Wall et al., 1992; Eberl & Schindlre, 1993)، تعیین جنسیت عملی گاو (Seidel et al., 1997;Seidel et al., 1999; Seidel et al.,2002) وتولید اعجاب انگیز گوسفند دالی که توسط Campbell وهمکاران از سلول های سوماتیک شبیه سازی شده بود، ادامه یافت (Campbell et al.,1996; Wilmut et al., 2007). فناوری تولید جنین در شرایط آزمایشگاه به ما اجازه ی تولید مقادیر انبوه جنین در مراحل تکاملی گوناگون را می دهد و از این رو بسیار مورد استقبال دانشمندان علوم زیستی تولید مثلی و بیوتکنولوژی قرار گرفته است.
1-3- ظرفیت پذیری اسپرم32
مادامی که اسپرم ها مسیر داخل لوله تناسلی ماده را طی نکرده اند ظرفیت کامل برای لقاح تخمک را ندارند. اسپرم باید تغییرات فیزیولوژیکی تکمیلی(ظرفیت پذیری اسپرم) را الزاما متحمل شود تا بتواند از لایه ی شفاف عبور کرده و با تخمک ادغام شود.
در واقع علت این امر که بسیاری از آزمایش های ابتدایی مربوط به لقاح آزمایشگاهی ناموفق بودند، عدم ظرفیت پذیری مناسب اسپرم بوده است. در طی ظرفیت پذیری، غشای پلاسمایی اسپرم متحمل واکنش های بیوشیمیایی شده و ناپایدار می گردد. در نتیجه این واکنش ها میزان نفوذپذیری غشاء به مواد مختلف به خصوص کلسیم تغییر می کند. این تغییرات ظاهرا به عنوان عامل اصلی برای واکنش آکروزومی عمل می نماید. واکنش های آکروزومی موجب متراکم شدن، شکسته شدن و نهایتا متخلخل شدن غشاهای پلاسمایی و خارجی آکروزوم می شوند. آکروزوم حاوی آنزیم هایی است که پس از متخلخل شدن از آن خارج شده و بافت هایی را که در اطراف تخمک در مسیر حرکت اسپرم قرار دارند هضم نموده و از بین می برند و در نتیجه اسپرم قادر خواهد بود وارد تخمک شود و آن را بارور نماید.
مطالعات نشان می دهد که شستشوی اسپرم قبل از انکوبه نمودن و قرار گرفتن در محیط های سرشار از یون و محیط های کلسیم دار می تواند واکنش آکروزومی را در محیط آزمایشگاهی هدایت کرده و عمل لقاح را سرعت بخشد(Wani et al.,2002).
1-4- لقاح آزمایشگاهی (IVF)
اسپرم دارای میزان زیادی پروتئین در سطح غشایی خود برای اتصال به پرده شفاف تخمک می باشد. فرآیند لقاح از زمانی شروع می شود که اسپرم به گیرنده های پرده شفاف اووسیت ثانویه متصل می شود. این رسپتورها به صورت اختصاصی عمل می نمایند به طوری که اسپرم گاو قادر به بارور ساختن تخمک گاو می باشد. در فرآیند لقاح اووسیت توسط اسپرم فعال می شود، به طوری که بدون وجود هیچ گونه محرکی، اووسیت باید قادر به تشکیل پرونوکلئوس ها و ایجاد زیگوت باشد. باز شدن سر اسپرم1-2 ساعت بعد از نفوذ در تخمک و شکل گیری پرونوکلئوس نر ظرف 5-3 ساعت از نفوذ رخ می دهد(Hyttel et al., 1989). از جمله تغییرات بیوشیمیایی که در اثر نفوذ اسپرم در تخمک حاصل می شود، تغییر در الگوی یون کلسیم داخل سلولی است که در طی پدیده لقاح موجب القای اگزوسیتوز گرانولهای کورتیکال و بلاک نمودن پلی اسپرمی می شود. عمده ترین مشکل در روند لقاح وقوع پلی اسپرمی است. در شرایط طبیعی33 دستگاه تولید مثلی ماده باعث کاهش تعداد اسپرم رسیده به تخمک می شود (Sun et al., 1993). Kim و همکارانش عنوان نمودند که انکوبه نمودن اووسیت در مدیای محتوی 10 تا 30 درصد مایع اویداکتی قبل از لقاح موجب افزایش مونواسپرمی بدون هیچ گونه اختلال در نفوذ اسپرم می شود. مایع اویداکتی حاوی فاکتورهای لازم برای ایجاد مونو اسپرمی و جلوگیری از پلی اسپرمی است(Kim et al., 1998) . نگهداری اسپرم و تخمک در خلال برنامه های بلوغ تخمک، ظرفیت پذیری اسپرم و لقاح یافتن تخمک ها معمولا در شرایط گرم خانه ای مخصوص (37 درجه سانتی گراد،5% گاز CO2 و حداکثر رطوبت) انجام می گیرد(Kim et al., 1998). در تخمک های پیر درصد لقاح چند اسپرمی بالاست و اگر تخمک خیلی پیر باشد، رشد رویانی، غیر طبیعی شده یا اینکه اصلا لقاحی صورت نمی گیرد. به نظر می رسد در محیط هایی که دارای آلبومین حرارت داده شده سرم خون یا آلبومین سرم خون گاو34 هستند، واکنش آکروزومی35 به مراتب راحت تر صورت می گیرد. همچنین لازم است یک منبع انرژی، مانند گلوکز یا پیرووات در محیط وجود داشته باشد تا از تحرک اسپرم و متابولیسم تخمک پشتیبانی کند (Kim et al., 1998).
برای مشاهده لقاح، می توان با مشاهده میکروسکوپی و یا با رنگ آمیزی و تثبیت نمودن تخمک ها 24-18 ساعت پس از لقاح به وقوع کلیواژ پی برد. درصد بالای لقاح در IVF، به وجود تعداد مناسب اسپرم های باروری که به شدت متحرک بوده و تخمک های باروری که دارای اولین گویچه ی قطبی هستند، بستگی دارد. بعضی از معیارهایی که به عنوان نشانه لقاح به کار می روند عبارتند از:
1. نفوذ اسپرم به داخل اووپلاسم
2. تورم سر اسپرم، تشکیل پیش هسته ی نر
3. تسهیم با ظاهر طبیعی، در جهت تشکیل بلاستومر
4. متلاشی شدن دانه های قشری
5. مشاهده دم یک اسپرم در اووپلاسم
هیچ یک از موارد فوق به تنهایی نمی تواند بیانگر لقاح طبیعی باشد، چرا که برای نمونه رویان های حاصل از بکرزایی36 هم، بعضی از معیارهای فوق را دارا هستند(Kim et al.,1998).
1-4-1- کشت جنین در آزمایشگاه(IVC) 37
تکامل جنین های پستانداران پیش از لانه گزینی، به صورت آزمایشگاهی38 با مشکلات زیادی همراه است. سیستم های کشت موجود نتوانسته اند شرایط محیطی و فیزیکی دستگاه تناسلی ماده را فراهم کنند.
در داخل سیستم تناسلی ماده، جنین در حال تکامل در معرض حجم کمی ازمایع قرار می گیرد و برعکس در محیط کشت، جنین در معرض حجم بیشتری از مایع قرار می گیرد. با وجود این، فاکتورهای اتوکرینی که به وسیله ی جنین ترشح می شود در حجم زیاد مایع رقیق شده و ممکن است بی اثر شود(Reed et al., 1992; Kane et al., 2003). اکنون ثابت شده که در موش سرعت کلیواژ و تشکیل بلاستوسیست با کم کردن حجم محیط افزایش می یابد. نتایج مشابهی نیز از جنین گوسفند به دست آمده است، درضمن فاکتورهای پاراکرینی هم که به وسیله سیستم تناسلی ماده ترشح می شود در محیط کشت وجود ندارد.
بنابراین در روش های اولیه ای که برای رشد جنین تدوین شده بود، محیط های کشت مورد استفاده پاسخ گوی احتیاجات رشد جنین نبود و رشد جنین پس از رسیدن به مرحله ی 16-8 سلولی متوقف می گردید. پیشرفت های قابل توجهی در تکامل تکنیک های تولید آزمایشگاهی جنین های پستانداران چه در عرصه تحقیقات و چه در زمینه اهداف تجاری انجام پذیرفته است. با این وجود میزان تولید آزمایشگاهی جنین بلاستوسیست هنوز نسبت به آنچه که در روش طبیعی39 وجود دارد، پایین است
(Kreysing et al., 1997).
دلیل این میزان پایین جنین هایی که به مرحله ی بلاستوسیست می رسند نامشخص است. اما اینگونه تصور می شود که این مکانیسم حمایتی برای جلوگیری از تکوین جنین های با کیفیت پایین و ناهنجار40 است(Betts & Madal,2008). آپوپتوزیس41 (مرگ برنامه ریزی شده سلول)،مکانیسمی برای حذف سلولهای صدمه دیده از توده جنین در حال رشد می باشد. بلاستومرهای با مشخصه آپوپتوزیس که دارای فراگمانتاسیون42 در سیتوپلاسم و هسته هستند، در جنین های in vivo و in vitro دیده می شود (Kamjoo et al., 2002).
1-5- تاریخچه انجماد جنین
پولگ و همکارانش در سال 1949 توانستند برای اولین بار اسپرماتوزوئید انسان را به کمک گلیسرول و پروپیلن گلیکول در دمایCº196- منجمد و سپس ذوب کنند و تعداد قابل توجهی اسپرماتوزوئید زنده بدست آورند. این موفقیت بزرگ محققین را بر این داشت تا دامنه تحقیق پیرامون انجماد و عوامل موثر در آن را گسترش بخشند و حاصل آن شناسایی روش های مختلف برای انجماد سلولهای گوناگون در دهه پنجاه و شصت قرن نوزدهم و ادامه آن تا زمان حاضر شد (Nemat Elahi, 1997 .(
عده ای از محققین برای مشاهده اتفاقاتی که در جریان انجماد و ذوب سلولها رخ می دهد به ساخت میکروسکوپهای انجمادی پرداختند و با مشاهده تغییرات آب درون و بیرون سلولی و چگونگی یخ زدن آن به پارهای از سوالات پاسخ گفتند و پرده ابهام از روی برخی از مسائل را کنار زدند. ادامه این تحقیقات در سال 1972 ویتینگهام را قادر ساخت جنین موش را در محیط آزمایشگاه منجمد-ذوب و سپس تا مرحله بلاستوسیست برساند.
روش انجماد آهسته برای اولین بار توسط Whitthingham و همکارانش در سال 1972 مطرح شد که توانستند برای اولین بار با موفقیت جنین دو سلولی موش را با موفقیت زیاد در نیتروژن مایع منجمد کرده و سالم بازیافت کنند و پس از انتقال به بدن مادر، نوزاد زنده به دنیا آوردند(Whittingham et al., 1972).
در سال 1985 Rall وFahy روش انجماد شیشه ای (Vitrification) را طراحی کردند (Rall et al.,1985). انجماد شیشه ای اشاره به یک پروسه فیزیکی است که یک محلول غلیظ ضد یخ در طی سرد شدن بدون تشکیل کریستال یخ، شیشه ای شود. شیشه تشکیل شده از نظر وزن ملکولی و توزیع یونی، نرمال باقی می ماند به عبارت دیگر انجماد شیشه ای بدون تشکیل یخ است در حالی که در انجماد آهسته تشکیل یخ الزامی است(Fahy et al., 1984 ) .
امروزه از انجماد سلولها و بافتهای فیزیولوژیک به روش انجماد شیشهای مدت زیادی می گذرد(Luyet., 1937; Luyet., 1940). به این ترتیب از وارد شدن آسیبهای داخل و خارج سلولی احتمالی جلوگیری می شود.(Mazur P et al., 1984) تحقیقات اخیر نشان داده که انجماد شیشه ای می تواند نقش مهمی در زنده ماندن جنین های گاو و موش داشته باشد
(Lehn- Jensen et al., 1983; Wilmut et al., 1973; Rall et al., 1980; Ral et al., 1984).
مشاهدات میکروسکوپی این جنینها نشان داد که انجماد آهسته تا درجه حرارت 25- تا 40- سانتی گراد باعث می شود که آب سیتوپلاسم خارج شده و مایع موجود در خارج سلول نیز غلیظ شود (Leibo., 1977; Leibo., 1978) ولی در انجماد شیشه ای مایع باقی مانده در خارج سلول و آنچه در داخل سلول باقی مانده است شیشهای می شود
(Lehn- Jensen et al., 1983; Wilmut et al., 1973; Rall et al., 1980).
میزان زنده ماندن جنین ها وابسته به سرنوشت سیتوپلاسم شیشهای شده در طی ذوب می باشد. اگر در این مرحله سیتوپلاسم در طی مدت زمان طولانی از حالت انجماد شیشه ای با تشکیل کریستال یخ خارج شود میزان زنده ماندن کم است، اما اگر ذوب سریع صورت گیرد که دیگر زمان کافی برای تشکیل کریستال وجود نداشته باشد(Luyet., 1937) میزان زنده ماندن بیشتر است .(Rall et al., 1984) در انجماد شیشه ای جنین شرایط خاصی مورد نیاز است. ابتدا باید جنینها در محلول ضد یخ قرار گیرند و در آن آبگیری شوند .(Fahy et al., 1937)
1-6- حفاظت انجمادی
دانش حفاظت انجمادی مطالعه اثر کاهش دما بر روی ارگانیسم های زنده می باشد که از30 سال تا کنون مطالعات و تحقیقات زیادی در این زمینه صورت گرفته است. سرد کردن مواد بیولوژیک در دمای 196- درجه سانتیگراد به وسیله نیتروژن مایع حفاظت انجمادی نامیده می شود که استفاده از این تکنیک در زمینه فیزیولوژی تولید مثل امکان ذخیره تخمک، جنین، اسپرم و بافت های تولید مثلی را برای مدت طولانی فراهم می کند(Shaw et al., 2003).
شش مرحله به منظور حفاظت انجمادی سلول ها و بافت های بیولوژیک وجود دارد که عبارتند از:
1. مواجه شدن با مواد محافظ انجمادی43
2. سرد کردن در دماهای زیر صفر درجه سانتیگراد
3. ذخیره در نیتروژن مایع 44(LN2)
4. ذوب کردن (گرم کردن)45
5. حذف مواد محافظ انجمادی
6. برگرداندن به محیط کشت(Liebermann et al., 2003)
جهت حفظ انجمادی جنین ها بر اساس سرعت و میزان سرد کردن دو روش اصلی وجود دارد:
1. سرد کردن آهسته46 (انجماد کند)
2. انجماد شیشه ای47 (Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005)
1-7-انجماد کند (آهسته)
سالهای زیادی به طول انجامید تا بشر توانست جنین پستانداران را با موفقیت منجمد و ذوب کند. وجود آب درون سلولی فراوان در تخمک و جنین پستانداران و یخ زدن آن در جریان انجماد و ذوب، مانع بزرگی بر سر راه موفقیت آن بود. در حقیقت اغلب روشهای انجماد سلول که تا آن زمان به کار گرفته می شدند نمی توانستند از تشکیل بلورهای یخ درون جنین پیشگیری کنند و معمولا انجماد جنین به مرگ آن منجر می شد. با توجه به اینکه خروج آب از سلول در شرایط ویژه باعث مرگ سلول نمی شود و نگهداری طولانی مدت سلولها در دمای پایین نیز آنها را نمی کشد باید سوال کرد که چرا سلولها در جریان انجماد و ذوب می میرند. باید گفت آنچه برای یک سلول کشنده است دمای حدواسطی (حدود 15- تا 60- درجه سانتی گراد) است که سلول دو بار با آن رو به رو می شود. یک بار در جریان انجماد و بار دیگر در جریان ذوب (Mazur., 1984)، دمای گفته شده از این جهت کشنده است که بیشتر سلولها در این محدوده دمایی شروع به یخ زدن می کنند و در صورتی که قبل از رسیدن به این دما، در روش انجماد کند، آب درون سلولی به خوبی خارج نشده باشد امکان آسیب سلولی وجود دارد. در حالی که در دمای 196- درجه سانتیگراد (نیتروژن مایع) تقریبا تمام ملکولهای آب یخ می زنند و از سویی انرژی حرارتی لازم برای واکنشهای حیاتی سلولها نیز وجود ندارد و بدین ترتیب کلیه واکنشهای حیاتی سلولی متوقف می شود و نگهداری طولانی مدت سلولها در این دما هیچگونه تاثیر منفی روی سلولها نمی گذارد. تنها واکنشهایی که در دمای 196- درجه سانتی گراد متصور است واکنشهای فتوفیزیکی است، همانند ایجاد رادیکالهای آزاد و شکست ماکروملکولها که در اثر تابش اشعههای یونیزان ممکن است رخ دهد (Rice, 1960) با گذشت زمان چنین عواملی ممکن است به تدریج در ملکولهای DNA شکست ایجاد کنند.
آزمایشات Lyon در سال 1981 نشان داد سلولهایی که به مدت 5 سال در حالت منجمد در معرض تشعشعی 100 برابر بیشتر از تشعشع طبیعی قرار گرفته بودند هیچگونه تغییر کروموزومی از خود نشان ندادند و نگهداری سلولها به مدت 15-2 سال در شرایط انجماد تاثیر منفی بر آنها نداشته است (Mazur., 1984) همچنین نگهداری سلولها در نیتروژن مایع باعث افزایش تغییرات کروموزومی و تجمع این تغییرات در سلول نشده است .(Ashwood et al., 1979)
فرایند سرد کردن آهسته با استفاده از مواد محافظ انجمادی با غلظت کمی در حدودmol/l 2-1 و سرعت سرمای پایین(0/1-1°c/min) انجام می گیرد. در طی این فرایند سلول در طی چند مرحله آبگیری48 شده و سپس نمونه با کمک دستگاه فریزر49
در-7°c با سرعت 1-2°c/min به آرامی به مدت 10 تا 15 دقیقه سرد می شود. در مرحله بعد نمونه با سرعت 0/3°c/min در دمای -30°c سرد شده و سپس در نیتروژن مایع ذخیره می شود. لازم به ذکر است که میزان سرد کردن سلول با توجه به اندازه و نفوذ پذیری سلول تعیین می شود که با کمک دستگاه فریزر برنامه ریزی و تنظیم می شود(Shaw et al., 2003; Jain et al., 2006). میزان سرمایی که به منظور سرد کردن آهسته تخمک ها و جنین ها استفاده می شود 0/3°c/min تا 1 می باشد که بر اساس اندازه و میزان نفوذ پذیری آنها به مواد محافظ انجمادی، پایین تر از سلولهای سوماتیک50،اسپرم یا اریترو سیت51 ها می باشد (<100°c/minتا(1 (Shaw et al., 2003).
موفقیت در انجماد آهسته بستگی به دستیابی به بهترین تعادل بین میزان خروج آب از سلول و تبدیل آن به یخ در خارج از سلول دارد. تعادل توسط غلظت پایین مواد محافظ انجمادی و میزان سرمای آهسته قابل دستیابی است و اجازه می دهد که آبگیری در طول سرد شدن اتفاق بیافتد (Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005).
علیرغم استفاده از فرایندهای انجماد آهسته به منظور حفاظت انجمادی جنین ها و تخمک های انسانی، تخمک ها و جنین های گونه های اهلی مانند خوک و گاو حساسیت سرمایی بسیار بیشتر و بازدهی کمتری نسبت به تخمک ها و جنین های انسانی دارا می باشند (Shaw et al., 2003). از طرف دیگر نگهداری تخمک ها و جنین های انسانی تحت سرما از 90 دقیقه تا 5 ساعت طول می کشد که این میزان سرمای آهسته باعث ایجاد تعادل بین فاکتورها می شود ولی باعث تشکیل کریستالهای یخ، شوک اسمزی52، آسیب های سرمایی مانند شکسته شدن غشای شفاف53، بلاستومر54هاو تغییرات اسکلت سلولی نیز می شود (Orief et al., 2005). به علت معایب و آسیب های ناشی از انجماد آهسته، راهکاری در جهت کاهش زمان فرایند حفاظت انجمادی، حذف تجهیزات گران قیمت و کاهش تشکیل کریستالهای یخ به منظور حفظ و ذخیره تخمک و جنین گونه های مختلف اتخاذ شده است که این فرایند انجماد شیشه ای نامیده می شود (Shaw et al., 2003; Orief et al., 2005).
1-8- انجماد شیشه ای
انجماد شیشه ای یک روش جدیدی است که در آن از تشکیل یخ خارج سلولی و داخل سلولی جلوگیری می شود و یک وضعیت شبیه به شیشه ایجاد می شود. انجماد شیشه ای تکنولوژی ساده، سریع و ارزانتر از روش انجماد آهسته می باشد (Varghese et al., 2009) که از سال 1970 تا کنون در جهت حفاظت انجمادی مواد بیولوژیک به کار گرفته شده است (Shaw et al., 2003). در دماهای پایین محلولها بسیار غلیظ می شوند و یک حالت جامد بدون اینکه بلور یخ تشکیل شود ایجاد می شود این حالت در اثر دهیدراسیون و افزایش بسیار زیاد در غلظت رخ می دهد که سرعت های بسیار زیاد انجماد از ºC/min 30000-15000 عامل آن است (Liebermann et al., 2003).
وضعیت انتقال شیشه ای (Glass transition) در دمای حدود 130- درجه سانتی گراد رخ می دهد.(Kasai & Mukaida, 2004) ولی می تواند این دما با توجه به اجزای محلول انجماد شیشهای متغییر باشد.
انجماد شیشه ای محلولها از زمان 1948 انجام شده است (Kauzmann, 1948) ولی اولین بار نگهداری رویان موش در 1985 میلادی انجام گرفت (Rall & Fahy, 1985). یک سال بعد اولین رویان گاو که بطور موفق بطور شیشه ای منجمد شد گزارش شد (Massip et al., 1986). پیشرفتهایی در زمینه انجماد شیشه ای از تاریخ استفاده از مواد شیمیایی با سمیت پایین و قابلیت نفوذ بیشتر و نیز استفاده از ترکیب ضد یخ ها برای کاهش سمیت و استفاده از روش مرحله ای55 برای تعادل و نیز افزایش سرعت انجماد و ذوب صورت گرفته است (Vajta & Kuwayama, 2006).
Fahy در سال 1984 در مقاله ای با توصیف انجماد شیشه ای و عوامل موثر در آن پیشنهاد کرد که این روش بتواند برای نگهداری سلولها و اعضاء بکار گرفته شود. وی می گوید، به کمک انجماد شیشه ای در جریان انجماد جنبش ملکولها متوقف شده و ساعت بیولوژیک از کار می افتد در حالی که آندسته از تغییراتی که در جریان انجماد کند در سلولها رخ می دهد پیش نمی آید. Rall و Fahy برای انجماد جنین 8 سلولی موش از روش انجماد شیشه ای استفاده کردند. آزمایشات Rall نشان داد در صورتی که مقدار مواد ضد یخ در محیط افزایش یابد(<40% حجم محلول) آب داخل و خارج سلول در جریان انجماد به بلورهای یخ تبدیل نمی شوند بلکه در عوض بدون افزایش حجم به مادهای غلیظ و سرد تبدیل می شوند و در نتیجه به سلول آسیب نمی رسانند. همین محقق با همکارانش در سال 1987 در مقاله ای اصول حاکم بر انجماد شیشه ای را بررسی کرد و با مرور مطالعات گذشته اظهار کرد که از این روش می توان در انجماد سلولها و برخی از بافتها استفاده کرد. در حقیقت در این روش با جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ متعاقب افزایش غلظت مواد موجود در جنین و محلولی که جنین در آن قرار گرفته از بروز صدمات وارده به دنبال تشکیل بلورهای یخ جلوگیری می شود.
بدین منظور راههایی برای نیل به این هدف اندیشیده شده است:
1- افزایش سرعت انجماد، بطوری که محلول حاوی جنین فرصت کافی برای تشکیل و بزرگ شدن بلورهای یخ نداشته باشد. محاسبات نشان داده که حتی آب خالص در صورتی که در سرعت 10 میلیون درجه در دقیقه سرد شود بجای تشکیل بلور به مواد شبه شیشه تبدیل خواهد شد.
2- افزودن مقدار کافی ماده ضد یخ ابزار مفیدی است که به کمک آن می توان تشکیل بلورهای یخ را تحت کنترل در آورد. افزودن ضد یخ باعث کاهش نقطه انجماد، افزایش غلظت در دماهای زیر صفر و کاهش نسبی فشار اسمزی محلول می شود. بالا بردن فشار هیدراستاتیک در جریان انجماد نیز باعث کاهش نقطه انجماد شده و مشابه ضد یخ عمل می کند.
3- تقسیم محلول حاوی جنین به ذرات و قطرات کوچکتر بطوری که به مایع موجود اجازه تشکیل بلور یخ داده نشود.
مقدار محلول، ظرفیت لوله یا نی انجماد و نوع ضد یخ از عواملی هستند که در تعیین میزان ضد یخ و سرعت انجماد نقش دارند. اگر نمونه کوچک باشد و ضخامت نی کم باشد می توان آن را با سرعت زیاد سرد کرد و داخل نیتروژن مایع قرار داد لیکن اگر نمونه بزرگ باشد (مانند بافتهای جانوری) بایستی محلول را با سرعت کم سرد کرد و از غلظتهای مناسب ضد یخ برای انجماد استفاده کرد.
در آن زمان تصور می شد که برای یک انجماد شیشه ای موفق حتما بایستی عوامل زیر استفاده شوند:
1- یک ماده ضد یخ با وزن ملکولی پایین که براحتی و به سرعت بتواند وارد جنین شود مانند DMSO غلظت چنین ضد یخی نیز باید بالا باشد
2- استفاده از مادهای مانند استامید که با تکیه بر قابلیت برخی از آمیدها در کاهش سمیت موادی مانند DMSO برای کم کردن سمیت ضد یخ بکار می رفت.
3- استفاده از ترکیب یونی به منظور بر قرار کردن خاصیت ایزوتونیک محلول و متناسب کردن فشارهای اسمزی درون و بیرون سلولی
4- استفاده از موادی مانند پلی اتیلن گلیکول یا پلی ونیل پیرولیدون (PVP) که به علت وزن ملکولی بالا نمیتوانند به داخل سلول نفوذ کنند و دارای خواص ضد انجمادی بوده و با پایین آوردن نقطه انجماد به عنوان یک ضد یخ نفوذ ناپذیر بکار گرفته می شود. ولی تحقیقات بعدی توسط Massip و همکارانش ضمن معرفی محلول جدیدی برای روش انجماد شیشهای نشان داد که حضور تمام مواد پیشنهاد شده توسط Rall برای انجماد شیشه ای ضرورت ندارد، محلول ضد یخی که Massip و همکارانش استفاده کردند مخلوطی از 4/3 مول گلیسرول، 4/3 مول پروپیلن گلیکول بود به علاوه از ماده ای مانند استامید استفاده نشده بود و غلظت ضد یخ نفوذ ناپذیر (ماکروملکول) نیز در آن بشدت کاهش یافته بود (حدود 3/0 درصد) وی گزارش کرد که این محلول برای حفاظت جنین گاو و موش در مرحله مورولا و بلاستوسیست قابلیت خوبی داشته است. هر چند که این محلول برای نگهداری بلاستوسیست ها به خوبی مورولا نبوده است (Massip et al., 1986).
Valdez با بکار گیری همان ضد یخ هایی که Massip استفاده کرده بود تاثیر زمان تعادل، درجه حرارت محیط قبل از انجماد و مرحله رشد56 را در موفقیت روش انجماد شیشه ای بررسی کرد. وی جنین های مرحله 8 سلولی، مورولا و بلاستوسیست را به مدت 5، 10، 15 و 20 دقیقه در دو محلول ضد یخ قرار داد. یکی از محلولها قبلا تا دمای 4 درجه سانتی گراد سرد شده بود و دیگری در حرارت آزمایشگاه قرار داشت پس از آن جنین ها را با نی های مخصوص انجماد منتقل و وارد نیتروژن مایع کرد جنین های منجمد پس از 1 تا 64 روز از نیتروژن خارج و با سرعت زیاد ذوب شدند. جنین های زنده پس از شستشو در محلول فسفات بافر به قطرات محیط کشت منتقل شدند.
نتایج از مطالعات وی نشان داد که:
1- مناسب ترین زمان تعادل بسته به مرحله جنین فرق می کند بطوری که برای جنین های 8 سلولی و بلاستوسیست 10 دقیقه و برای مورولا 5 الی 20 دقیقه بود.
2- دمای ضد یخ در مرحله تعادل بر درصد زنده ماندن و رشد جنین ها تاثیر دارد. جنین هایی که در محلول ضد یخ 4 درجه سانتی گراد قرار گرفته بودند رشد بهتری نسبت به آنهایی که در دمای 20 درجه سانتی گراد قرار داشتند نشان می دادند.
3- مرحله رشد جنین در موفقیت انجماد شیشهای تاثیر دارد بطوریکه جنین های مرحله مورولا، 8 سلولی و بلاستوسیست به ترتیب بیشترین مقدار رشد را نشان می دادند.
در یک جمع بندی از نظریات مختلف محققین که روش انجماد شیشه ای را برای منجمد کردن جنین بکار بردهاند می توان گفت:
1- انجماد شیشه ای بدلیل جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ در زمان انجماد و ذوب مانع از آسیب رسانیدن بلورهای یخ به جنین می شود و با پیشرفت تحقیقات کاربردهای زیادی پیدا می کند. فرایند انجماد شیشه ای با استفاده از غلظت های بالای مواد محافظ انجمادی (5-7 M) و سرعت سرمای بسیار بالا (20000-200000°c/min) باعث جامد شدن محلولها به شکلی شبیه شیشه (فاقد ساختار کریستالی) می شود (Shaw et al., 2003; Varghese et al., 2009). تا کنون این روش در بسیاری از حیوانات آزمایشگاهی و اهلی بکار گرفته شده و نتایج قابل قبولی بدست آمده است.
2- زمان تعادل محیط ضد یخ و جنین اهمیت فراوانی دارد و کنترل آن برای یک انجماد موفق لازم است. افزایش زمان تعادل باعث بروز مسمومیت در جنین می شود. وزن ملکولی ضد یخ و سرعت ورود آن به جنین نیز در انتخاب زمان تعادل مناسب تاثیر می گذارد. هر چند که بنظر می رسد هر چه میزان ضد یخ در جنین بالاتر رود امکان یخ زدن داخل جنین کاهش می یابد اما باید در نظر داشت که به علت سمیت ضد یخ ها افزایش غلظت ضد یخ درون سلول به آن آسیب می رساند. برای مقابله با این مشکل برخی از محققین پیشنهاد کردهاند که ضد یخ را در چند مرحله وارد محیط کنند و بتدریج غلظت را افزایش دهند. بدین ترتیب ضمن افزایش غلظت ضد یخ در جنین از اثرات ناشی از افزایش فشار اسمزی جلوگیری می شود. به هر حال تحقیقات نشان داده که در اکثر گونه های حیوانات زمان تعادل مناسب بین 5/0 تا 2 دقیقه است.
3- حرارت محیط تعادل نیز در موفقیت انجماد شیشهای اهمیت دارد. با توجه به اینکه هر چه حرارت محیط بیشتر باشد نفوذ ضد یخ به داخل سلول سرعت بیشتری می گیرد و از طرفی به علت افزایش متابولیسم سلول احتمال تخریب سلولی متعاقب ورود مقادیر زیاد ضد یخ نیز افزایش می یابد، عده ای از محققین به این نتیجه رسیده اند که بهتر است ضد یخ را در دمای 4 درجه سانتی گراد وارد سلول کنند و یا در صورتی که ضد یخ را در چند مرحله وارد سلول می کنند مراحل نهایی را در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام میدهند. هر چند که عده ای از محققین توانسته اند در دمای 20 درجه سانتی گراد نیز نتایج بسیار خوبی بدست آورند. به هر حال باید در نظر داشت که نوع و غلظت ماده ضد یخ در انتخاب دمای تعادل اهمیت ویژه ای دارد.
4- بر خلاف آنکه ابتدا تصور می شد برای انجماد شیشه ای بایستی از مواد ضد یخی استفاده کرد تحقیقات بعدی نشان داد که استفاده از دو ضد یخ به طور همزمان و حتی یک نوع ضد یخ می تواند کاربرد داشته باشد. نکته ای که حائز اهمیت است استفاده از ضد یخ در غلظت بالا است بطوری که مقدار ضد یخ در محلول بایستی بیش از 40 درصد باشد. با توجه به خواص مختلف و سمیت متفاوت ضد یخ ها به هر حال بایستی غلظت ضد یخ را طوری انتخاب کرد که در عین بالا بودن غلظت که احتمال تشکیل بلور یخ را کاهش می دهد سمیت آن به جنین لطمه نزند. مطالعات نشان داده که در بسیاری از موارد مخلوطی از DMSO و اتیلن گلایکول می تواند به عنوان ضد یخ مناسب استفاده شود لیکن گونه حیوان و مرحله رشد جنین نیز در استفاده از ضد یخ



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید