معاونت پژوهش و فناوری
منشور اخلاق پژوهش
با یاری از خداوند سبحان و اعتقاد به این که عالم محضر خداست و همواره ناظربر اعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت
جایگاه دانشگاه در اعتلای فرهنگ و تمدن بشری ، ما دانشجویان و اعضاء هیات علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد میگردیم اصول زیر را در انجام
فعالیت های پژوهشی مد نظر قرار داده و از آن تخطی نکنیم:
1-اصل برائت : التزام به برائت جویی از هرگونه رفتار غیر حرفهای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبههای غیر علمی میآلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت : تعهد به اجتناب از هرگونه جانب داری غیر علمی و حفاظت از اموال ، تجهیزات و منابع در اختیار.
3- اصل ترویج : تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد .
4- اصل احترام : تعهد به رعایت حریمها و حرمتها در انجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری از هرگونه حرمت شکنی.
5-اصل رعایت حقوق : التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان ( انسان ، حیوان و نبات ) و سایر صاحبان حق .
6- اصل رازداری: تعهد به صیانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد ، سازمانها و کشور و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی : تلاش در راستای پی جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هرگونه پنهان سازی حقیقت.
8-اصل مالکیت مادی و معنوی : تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی : تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظر داشتن پیشبرد و توسعه کشور در کلیه مراحل پژوهش
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
در رشته بیوشیمی
عنوان:
تغییرات فعالیت سطح سرمی آنزیم پاراکسوناز 1 به دنبال آسیب های ناشی از سوختگی حرارتی
استاد راهنما:
دکترسعید صفری
استاد مشاور:
دکتر بستان رودی
دکتر افشین امینی
نگارش:
محسن پرورشی همراه
تابستان1394
فهرست مطالب
توپولوژی عموم 3
اصول جداسازی8
ترکیبیات 9
2 تعداد توپولوژی های روی یک مجموعه متناهی
توپولوژی هایی باکمترین تعداد از مجموعه های با14
توپولوژی ها بابیشترین تعداد مجموعه های باز 14
3 تعداد توپولوژی های محدب روی یک مجموعه متناهی ترتیب کلی
3-1 توپولوژی های محدب آشیانه ای…………………………………………………………………………………………………………………..32
3-2 Tcvx(n)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
4 اندازه کمین ممکن برای یک مجموعه تحت یک توپولوژی معین
4-1 به دست آوردن تعداد(n, k) T 41
4-2 شرح ماشینی44
4-3 کران های نمایی 49
4-4 معین کردن اندازه مینیمال مجموعه57
4-5 کارایی بهتر58
4-6 مقایسه نوع دیگری از دنباله ها60
مراجع
واژه نامه فارسی به انگلیسی 65
واژه نامه انگلیسی به فارسی67

فهرست جدول ها
3-1 TNest(n, k)تعدادی از توپولوژی ه ای روی یک مجموعه-n نقطه ای ترتیب کلی شامل مجموعه محدب آشیانه ای است33
3-2 تعداد Tcvx(n) و Tnest(n) از توپولوژی محدب آشیانه ای و توپولوژی محدب روی یک مجموعه ی ترکیب کلی –n نقطه ای، و تعداد T(n) از توپولوژی روی یک مجموعه ی –n نقطه است40
4-1 تعدادی از اعداد مینیمال از نقاط m(k) هستند که برای ساختن یک توپولوژی دارای k مجموعه باز در محاسباتی در (27) به ازای ]٢, ٢۵ k ∈ [ نیاز داریم44
4-2 مقادیر f(n)را به ازای 10 n≤بدست می آوریم ، در سطر پایین اندازه اندازه کوچکترین توپولوژی که بیشتر از 1 است، با استفاده از قضیه بالا بدست نمی آید، در این صورت 4/(2- (n23از قضیه بالا بدست می آید، واعداد بدست امده را برای اینکه به اعداد صحیح تبدیل شوند، به سمت پایین روند می کنیم44
فهرست شکل ها
گراف جهتدار رابطهR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8
2-1 شبکه ای از مقسوم علیه های عدد صحیح 60 است که به صورت مرتب تقسیم شده است………………………………………………………….14
2-2 شبکه ای از ریز مجموعه های {x, y, z}………………………………………………………………………………………………………………………………………….15
1……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19
2………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………20
شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n ………………………………………………………………………………………………………………………………….21
شکل های توپولوژی برای) ,16 T(n …………………………………………………………………………………………………………………………………….22
4………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26
5………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
6………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….28
3-1 یک نمونه از توپولوژی روی(8و1) است……………………………………………………………………………………………………………………………………………….37
3-2 در مثال ممکن است نقطه اضافه شده به خارج همسایگی ها شامل هیچ یک از همسایگی ها نباشد یا خارج دوتا همسایگی باشد و شامل یک همسایگی و همچنین امکان دارد شامل سه همسایگی باشد……………………………………………………………………………………………………….38
3-3 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر همسایگی مینیمال MN(J) بسطی برای
(8و1)j ∈ نباشد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………38
3-4 امکان انتخاب برای MN(9) وجود دارد اگر MN(2)و MN(6) بسطی شامل 9 باشند…………………………………………………………………………39
4-1 مجموعه ترتیب جزئی) P(T° مربوط به توپولوژی القاء شده T° به وسیله توپولوژیT در مثال2.4 اس
4-2 شیوه قضیه 3.3 به ازای K=105که در آن K2=1101001 است……………………………………………………………………………………………………………51
4-3 شیوه قضیه 7.3 به ازای K=5550 که در آن K2=1010110101110 دوگان ایده آل مرتب یکریخت به • ⊕• است، که به وسیله روش دایره ای تعریف می کنیم. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
4-4 یک روش کارا برای ساختن یک مجموعه ترتیب جزئی با 65535 پادزنجیر با استفاده از 19 عنصر است59
4-5 شیوه قضیه 3.3 را برای K=4681 بکار می بریم………………………………………………………………………………………………………………………………………60
چکیده :
مقدمه: سوختگی با واکنش های التهابی و تولید رادیکال آزاد از جمله ROS و RNS و کاهش سیستم ایمنی بدن همراه است. بنابراین این مطالعه به منظور بررسی استرس اکسیداتیو و آنزیم پاراکسوناز (PON1) به عنوان یک شاخص آنتی اکسیدانی در بیماران دچار آسیب سوختگی حرارتی و مقایسه با افراد سالم طراحی شد. مواد وروش ها: در این مطالعه مورد شاهدی 57 بیمار سوختگی حرارتی که در بخش اورژانس بستری شده بودند و حداکثر 4 ساعت از سوختگی آنها گذشته شده بود به عنوان مورد و 57 فرد سالم که از نظر سن و جنس با گروه مورد همسان سازی شد به عنوان کنترل وارد مطالعه شد .فاکتور های بیوشیمیایی، علائم حیاتی و فعالیت آنزیم پاراکسوناز (PON1) در هر دو گروه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: ارزیابی های کلینیکی و آزمایشگاهی در افراد مورد مطالعه نشان داد تعداد ضربان قلب (04/0=p)، تعداد تنفس (001/0>p)، سطح گلبول سفید خون (001/0>p)، سطح پلاکت پلاسما (03/0=p)، سطح قند ناشتای خون (001/0>p)، سطح کلسترول تام (007/0=p)، سطح HDL (001/0>p)، سطح SGOT (001/0>p)، سطح SGPT (01/0=p)، سطح پتاسیم (001/0>p)، سطح کلسیم (04/0=p) و سطح آلبومین سرمی (001/0>p) اختلاف معنی داری بین دو گروه دارد. شایان ذکر است سطح فعالیت پاراکسوناز در گروه دچار سوختگی حرارتی به طور معنی داری کمتر از گروه کنترل بود (001/0>p). یافته های مطالعه حاضر نشان داد حتی پس از تعدیل آنالیزها برای فاکتورهای احتمالی تاثیر گذار بر سطح پاراکسوناز شامل سطح HDL، فعالیت کبدی، مصرف دخانیات و سطح آلبومین پلاسما رابطه معنی داری بین سطح پاراکسوناز و سوختگی وجود دارد بدین مفهوم که سطح این آنزیم پلاسمایی در بیماران دچار سوختگی کمتر از افراد سالم می باشد (03/0=p). نتیجه گیری: بررسی سطح فعالیت این آنزیم می تواند به عنوان یک بیومارکر در ارزیابی شدت ضایعات دراز مدت ناشی از سوختگی و یا حتی یک نقطه درمانی مفید باشد. با توجه به اینکه می توان پاراکسوناز جهش یافته با فعالیت و حلالیت متفاوت تولید نمود که پتانسیل تولید واریته های از پاراکسوناز با فعالیت بالاتر در حذف پراکسید های لیپیدی و یا فعالیت بیشتر علیه سموم ارگانوفسفات دارند. لذا با انجام تحقیقات بیشتر در این زمینه می توان امیدوار بود که سنجش فعالیت پاراکسوناز جهت پیش آگهی بیماران دچار آسیب سوختگی حرارتی در نظر گرفته شود.
هدف از مطالعه
در افراد نرمال، تعادل بین آنتی اکسیدن ها و اکسیدان ها وجود دارد. افزایش در غلظت اکسیدان ها یا افت آنتی اکسیدانی منجر به ازدست رفتن این تعادل و به وجود آمدن حالتی به نام استرس اکسیداتیو می شود به نظر می رسد استرس اکسیداتیو نقش مهمی در پاتوژنر بیماری آسب سوختگی از طریق آسیب مستقیم، یا درگیر کردن مکانیسم های مولکولی موثر در التهاب بافتی داشته باشد. رادیکال های آزاد بواسطه شروع وقایعی که منجر به تخلیه آنتی اکسیدانی می شود سبب القا استرس اکسیداتیو می شود.
آنزیم PON 1 که برروی HDL واقع می باشد مسئول هیدرولیز پراکسید های لیپیدی و بنابراین محافظت در برابر استرس اکسیداتیو ایفا کند. فعالیت و پلی مورفیسم PON1 بر توانایی HDL افراد در جلوگیری از التهاب موثر است. بنابراین اندازه گیری سطح فعالیت آن در عوارض سوختگی و التهاب های ناشی از رادیکال های آزاد به منظور اهداف درمانی می تواند مفید باشد.
فعالیت PON1 در بین افراد مختلف متفاوت می باشد و فاکتور های متعددی در این امر دخیل است. پلی مورفیسم ژنتیکی در ژنوم PON1 یک فاکتورتاثیر گذار در مقداری از این تغییرات میباشد. از پلی مورفیسم ژن پاراکسوناز در موقعیت های M/L 55 وQ/R 192 چندین ایزوزیم ایجاد می شود که فعالیت شان نسبت به سوبستراهای گوناگون متفاوت می باشد.
در این مطالعه فعالیت سرمی آنزیم PON1 در 57 بیمار مواجهه یافته با سوختگی و 57 نفر از افرادسالم با سن وجنس و بدون هیچ بیماری زمینه ایی مورد مطالعه قرار گرفت.
با توجه به عوارض التهاب در بیماران دچار سوختگی و عدم تعادل اکسیدان / آنتی اکسیدان در بیماران دچار سوختگی بر آن شدیم در این مطالعه فعالیت آنزیم PON1 را در بیماران دچار سوختگی بستری شده در بیمارستان سوانح و سوختگی مطهری تهران را بررسی کنیم .
با وجود ناشناخته بودن مکانیسم عوارض دیررس ناشی از سوختگی در ایجاد ضایعات سوختگی، این مطالعه به منظور تعیین ارتباط آنزیم PON1 به عنوان یک عامل مهم آنتی اکسیدانی با شدت بیماری و عملکرد بافت در ضایعات سوختگی انجام شد. هدف اصلی این مطالعه تعیین ارزشمندی فعالیت PON1 به عنوان یک بیومارکر برای تشخیص حساسیت افراد به بروز عوارض سوختگی، شدت بیماری و عملکرد بافت در ضایعات سوختگی ناشی از التهاب میباشد.
مقدمه:
انواع رادیکال آزاد:
به طور کلی رادیکال های آزاد در دو دسته قرار می گیرند:
رادیکال آزاد اکسیژن دار (که زیر مجموعه ای از ROS ها هستند ) و رادیکال آزاد فلزی
رادیکال آزاد اکسیژن دار
رادیکال آزاد را به صورت (R°) نشان می دهند واژه گونه فعال اکسیژن (ROS) اغلب به رادیکال آزاد و دیگر ترکیبات اکسیژن فعال از جمله اکسیژن یکتا (O°) ، پراکسید هیدروژن (H2O2) نیز اطلاق می شود که قادرند که الکترون را از سوبسترا های مختلف به سادگی دریافت کنند و آنها را به رادیکال آزاد تبدیل نمایند . تمام این ترکیبات قدرت انجام واکنش های رادیکالی را دارند(1). مهمترین رادیکال های آزاد در سیستم های زنده، آنیون سوپراکسید (O2) ، رادیکال هیدروکسیل(OH°)، نیتریک اکسید (NO)، مشتقات رادیکالی پراکسیل لیپید(ROO°) و رادیکال های الکوکسیل (RO) هستند. هنگامی که یک رادیکال با یک مولکول غیر رادیکالی اندرکنش می دهد، مولکول هدف به یک رادیکال تبدیل می شود که خود میتواند این سری از واکنش ها را به صورت آبشاری ادامه دهد . ROSها در حقیقت با اکسید کردن مولکول های دیگر و تبدیل آن ها به ROS های جدید، باعث احیا و پایدار شدن خود می شوند. به این اکسید کننده های فعال، اکسیدان گویند. رادیکال های آزاد با بعضی از قسمت های سلول مثل DNA و غشای سلولی واکنش نشان داده و باعث تخریب عمل سلول یا حتی مرگ آنها می شوند. بیشترین اثر تخریبی رادیکال های آزاد متوجه غشا سلولی ارگانل ها داخل سلولی نظیر غشا میتوکندی ها است.
رادیکال های آزاد فلزی
بشتر بررسی های متمرکز بر سیمت و کارسینوژن بودن فلزات، بر نقش آنها در تولید گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن در سیستم های بیولوژیکی تاکید دارد. مطالعات نشان می دهد که فلزاتی ازقبیل آهن، مس، کروم، سرب، جیوه، نیکل و وانادیوم ROS تولید می کنند(2). فلزات دو ظرفیتی همانند آهن و مس موجود در زنجیره انتقال الکترون وآنزیم های مصرف کننده اکسیژن (به عنوان یک جز اصلی آنزیم یا کوآنزیم ) نقش اساسی در واکنش های اکسیداسیون و اتواکسیداسیون بازی می کند. برای مثال واکنش های اپی نفرین و ویتامین C با اکسیژن بدون یون اهن یا مس بسیار کند صورت میگیرد، بنابراین وجود اهن ومس به صورت آزاد در بدن انسان به دلیل تسریع در واکنش های اتواکسیداسیون مضر بوده و در واکنش با H2O2، رادیکال خطرناک OH را به وجود می آورند. پراکسید هیدروژن میتواند به رادیکال هیدروکسیل که بشدت آسیب رسان است تبدیل شود و یا می تواند متابولیزه شود و به صورت آب بدون ضرر دفع شود
بعضی از آنزیم ها از جمله گلوتاتیون پراکسیداز، پراکسید هیدروژن را به آب تبدیل میکنند. تبدیل H2O2 به آب ایجاد اکسیژن یگانه میکند که رادیکال آزاد نیست اما ایجاد ان طی واکنش های رادیکالی می تواند باعث واکنش بیشتر (بعنوان کاتالیزور) شود.
مکانیسم عمل رادیکال های آزاد
رادیکال آزاد به هر فرم (آنیونی، کاتیونی و خنثی) می تواند وجود داشته باشد و در هر صورت دارای حداقل یک تک الکترون آزاد می باشد که آن را (مولکول یا اتم رادیکالی ) از نظر انرژی و ترمودینامیک ناپایدار می کند و با حمله به مولکول های دیگر و گرفتن تک الکترون و یا از دست دادن الکترون خود می تواند به پایداری برسد و باعث ناپایدار شدن مولکول مورد تعرض و در حقیقت تبدیل آن مولکول به رادیکال آزاد شود. بنابراین یک واکنش زنجیره ای موجب افزایش رادیکال های آزاد می شود. تولید، افزایش و خاتمه رادیکال آزاد در سه مرحله انجام می شود(3).
مرحله شروع(initiation)
مرحله تکثیر(propagation)
مرحله پایانی(termination)
عملکرد و آسیب رسانی رادیکال های آزاد در بدن به دو صورت می باشد:
عملکرد مستقیم رادیکال های آزاد باعث تخریب پروتئین ، چربی و اسید نوکلئیک می شوند .
عملکرد غیر مستقیم رادیکال های آزاد باعث برهم زدن تعادل سیستم آنزیم های انتی اکسیدانی می شوند(3).
عوامل اکسیدانی در بدن موجود زنده
گونه های فعال اکسیژن یا عوامل اکسیدانی در بدن موجودات زنده دو منشا دارند، یا تولید آنها از طریق متابولیسم طبیعی بدن است و یا بر اثر عوامل خارجی ایجاد می شوند. به علاوه گونه های فعال اکسیژن در بدن موجودات زنده با حمله به ماکرومولکول های حیاتی بدن باعث تولید مشتقات رادیکالی این مولکول ها می شود که این مولکول های به نوبه خود به عنوان ROS عمل کرده و واکنش های آبشاری اکسیداتیو را انجام می دهند و به تدریج باعث تخریب بافتی می شوند.
عوامل اکسیدانی با منشا درونی
تولید رادیکال های آزاد در طی متابولیسم طبیعی بدن و اعمال فیزیولوژیک ضروری با عنوان تولید عادی رادیکال ها در نظام بیولوژیک نیز مطرح می شوند و مهمترین منابع تولید ان در بدن به شرح زیر است.
زنجیره تنفسی میتوکندری
زنجیره انتقال میتوکندی یکی از منابع داخلی عمده تولید رادیکال آزاد است. در سلول های هوازی احیای ناقص اکسیژن در زنجیره انتقال الکترون میتوکندری، رادیکال های آنیونی سوپراکسید را به داخل سیتوزل آزاد میکند رادیکال های سوپراکسید نسبتا غیر فعال اند اما می توانند به واسطه یون های فلزی مانند آهن و مس در تولید مواد فعال تری از قبیل پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل شرکت کنند.
بررسی ها نشان داد که میتوکندری مقدار معنی داری پراکسید هیدروژن تولید می کند. تخمین می زنند که تولید پراکسید هیدروژن تحت شرایط فیزیولوژیک حدود 2% جذب تام اکسیژن توسط موجود را در بر میگیرد. به هرحال شناسایی وجود رادیکال سوپراکسید در میتوکندری سالم به دلیل فعالیت بالای آنزیم سوپراکسید دسموتاز (SOD) مشکل است. همچنین یوبی سمی کوئینون به عنوان خنثی کننده اصلی اکسیژن در غشا های میتوکندری ذکر می شود(4).
رادیکال های سوپراکسید تشکیل شده در هر دوقسمت غشا داخلی میتوکندری به طورکامل در ابتدا به پراکسید هیدروژن و سپس توسط CU_SOD، ZN ( درواقع در فضای بین غشایی SOD ) و (Mn-SOD) (SOD، واقع در ماتریکس) سمی زدایی می شوند. اما سوپراکسید بواسطه نیمه عمر طولانی اش (50/0 ثانیه در غیاب رویشگر ها) موجب غیر فعال شدن آنزیم هایی از قبیل کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز و اکسیداسیون اجزای درون سلولی از قبیل گلوتاتیون می شوند.
عمل سیتوکروم P450
سیتوکروم P450 که در غشا شبکه آندوپلاسمی سلول های کبدی وجود دارد با هیدروکسیله نمودن سموم گرچه باعث افزایش حلالیت و دفع سریعتر آنها می شود ولی در حین این عمل سبب ایجاد محصولات فرعی اکسیداتیو می شود(5). پیشنهاد شده است که سیتوکروم P450 نیز منبع تولید گونه های فعال اکسیژن است. گونه های فعال اکسیژن به ویژه آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن احتمالا از طریق القا سایتوکروم آنزیم P450 (به دنبال شکست یا uncoupling چرخه کاتالیتیکی P450) تولید می شوند.
متابولیسم ایکوزانوئیدها (اسید چرب 10 کربنه)
پروستاگلاندین و لوکوترین ها از متابولیسم اسید آراشیدونیک حاصل می شوند که طی دو مسیر تولید و مصرف رادیکال های آزاد مشتق شده از O2 ساخته می شوند. همچنین رادیکال های آزاد اکسیژن در اثر فعالیت آنزیم سیکلواکسیژناز، آزاد و با فیدبک منفی، منجر به غیر فعال شدن سیکلواکسیژناز و مهار سنتز پروستاگلاندین ها می شوند.
فرایند فاگوسیتوز
فرایند فاگوسیتوز در عملکرد ایمنی بسیار مهم وحیاتی می باشد. در مرحله انفجار تنفسی در نوتروفیل ها و ماکروفاژها، آنزیم NADPH اکسیداز موجود در غشا پلاسمایی این سلول ها موجب احیا شدن اکسیژن و تبدیل آن به رادیکال سوپراکسید شده، سپس طی یک سری از واکنش هایی که با یون های فلزی کاتالیز می شود سایر رادیکال های آزاد حاوی اکسیژن را تولید میکند. لوکوسیت ها همچنین حاوی آنزیم های دیگری مثل میلوپراکسیداز هستند که باعث ایجاد HOCL از H2O2 می شوند .در نتیجه تخریب آنتی ژن های بلعیده شده توسط این سلول ها انجام می شود.
در ماکروفاژ فعال شده ما شاهد افزایش جذب اکسیژن هستیم که بسیاری از گونه های فعال اکسیژن از قبیل آنیون سوپراکسید، نیتریک اکسید و پراکسید هیدروژن را تولید می نماید.
رادیکال نیتریک اکسید
نیتریک اکسید در فرایند های فیزیولوژیکی زیادی از قبیل گشاد کنندگی عروق، انتقال پیام و غیره شرکت دارد. همچنین نقش دفاعی ضد باکتریایی در بدن از خود نشان می دهد. اما NO می تواند با دآمینه کردن بازهای DNA و یا تبدیل سیتوزین به اوراسیل و متیل سیتوزین به تیمین ایجاد جهش و درنتیجه تومور کند.
واکنش های پراکسی زومی
میکروزوم ها و پراکسی زوم ها نیز منابع تولید ROS می باشند. میکروزوم ها مسئول تولید 80 درصدی H2O2 در جایگاه های هیپراکسی در in vivo هستند(6) .مشخص شده است که تحت شرایط فیزیولوژیک پراکسی زوم های H2O2 تولید میکنند نه O2. اگرچه کبد اندام اصلی بوده و نقش پراکسی زوم آن در تولید H2O2 تام معنی دار است اما پراکسی زوم اندام های دیگر نیز دارای مکانیسم تولید H2O2 طی گرسنگی طولانی مدت است بیشتر واکنش های متابولیکی که محصول فرعی آنها H2O2 می باشد در اندامک درون سلولی پراکسی زوم انجام می گیرند و در این اندامک، آنزیم کاتالاز بیشتر پراکسید هیدروژن تولید شده را به محصولات بی ضرر آب و اکسیژن مولکولی تجزیه میکند.
عوامل اکسیدانی با منشا خارجی
سیگار
دود سیگار حاوی 300 تا 500 PPM رادیکال نیتریک اکسید (NO) می باشد. اکسید های نیتروژن (NOx) موجود در دود سیگار باعث اکسایش ماکرومولکول های حیاتی و کاهش سطح آنتی اکسیدان های بدن می شود.
فلزات دو ظرفیتی
فلزات دو ظرفیتی نظیر آهن و مس تولید رادیکال OH را از H2O2 افزایش می دهند . در بیماری هموکروماتوز که یک نقص ژنتیکی مردان است، روزانه مقادیر زیادی آهن جذب بدن می شود در نتیجه بیماری حاصل از اکسیدان ها در این افراد بیشتر مشاهده می شود(7).
اشعه های یونیزان
اشعه های یونیزان عامل خارجی مهمی در تولید رادیکال های آزاد مخصوصا گونه های فعال اکسیژن می باشند. معمولی ترین اشعه، اشعه UV می باشد که بر اثر تخریب لایه اوزون (O3) دارای اثرات سرطان زائی مخصوصا سرطان پوست است(8).
آلاینده های هوا
بسیاری از آلاینده های شیمیایی هوا ناشی از سوخت های سرب دار است که توسط وسایط نقلیه تولید می شوند، و همچنین مواد افزایش دهنده O3 اتمسفر نیز به عنوان اکسیدان محسوب می شوند.
داروها و سموم
اثرات سمی داروها در طی متابولیسم آنها در بدن و با ایجاد رادیکال های آزاد صورت می گیرد مثلا سیکلوسپورین باعث افزایش تولید گونه های فعال اکسیژن می شود. استامینوفن نیز باعث ایجاد سمیت در سلول های کبدی می شود که این عمل مربوط به ایجاد رادیکال های آزاد است(9) .درحالیکه منشا این عوامل مشخص شد به نقش آنها در ایجاد اختلالات احتمالی می پردازیم.
اثر رادیکال های آزاد بر ماکرومولکول ها
اثر رادیکال های آزاد بر پروتئین ها:
گونه های مختلف اکسیژن (رادیکال های اکسیژن) می توانند به طور مستقیم با پروتئین ها در جایگاه های خاص واکنش دهد، و رادیکال های پروتئین ایجاد شده نیز به نوبه خود می توانند به طور سریع در ساختمان پروتئین جابجا شوند زنجیره های جانبی اسید های آمینه به خصوص خیلی تحت تاثیر این رادیکال ها (بیشتر آلکوکسیل و پروکسیل ) می باشند.
اکسید شدن پروتئین ها بر اثر حمله رادیکال های آزاد حساسیت آنها به پروتئولیز و همچنین آب گریزی آنها را افزایش می دهد. راه های مختلف حمله پروتئین ها به نوع اکسیدان و رادیکال آزاد تولید شده بستگی دارد. رادیکال آزاد ممکن است با اسید های آمینه دارای گروه غیر اشباع یا سولفوری مانند تیروزین، فنیل آلانین، تریپتوفان، هسیتیدین، سیستئین، متیونین واکنش داده و باعث برهم زدن ساختمان پروتئین و یا ایجاد پیوند عرضی شود مراحل مختلف پروتئین سازی نیز می تواند توسط رادیکال های آسیب دیده و سنتز پروتئین متوقف شود در نتیجه در بسیاری از پدیده ها که حضور پروتئین ضروری است اختلال ایجاد می شود(10).
اثر رادیکال های آزاد بر لیپید ها
ایجاد رادیکال آزاد در سلول بوسیله پراکسیداسیون لیپید با جدا شدن اتم هیدروژن از کربن میتلن زنجیره اسید چرب شروع شود و هرچه اسید چرب غیر اشباع تر باشد یعنی تعداد بیشتری از پیوند دوگانه داشته باشد قابلیت پراکسید شدن بیشتری دارد. انتقال واکنش پراکسیداسیون بین زنجیره های اسید چرب مجاور باعث گسترده شدن پراکسیداسیون لیپید و تبدیل اسید چرب به لیپید هیدرو پراکساید شده که منجر به صدمات بافتی و نهایتا بیماری های مختلف می شود.
رادیکال های هیدروپراکسیل و هیدرواکسیل به زنجیره های غیر اشباع یا دارای پیوند دوگانه C=C حمله کرده و باعث اکسیدشدن فسفولیپید ها و سایر چربی های غشایی شده و همچنین با کاهش نسبت کلسترول به فسفولیپید ها باعث کاهش سیالیت غشا ودر حقیقت کاهش ثبات غشاهای سلولی می شوند و به دلیل اینکه غشا نقش بسیار مهمی در محافظت و تبادل سلولی دارد، مسئله پراکسیداسیون لیپید ها بسیار با اهمیت می باشد. بسیاری از بیماری های حاصل از رادیکال های آزاد، مربوط به اثر آنها بر لیپید های غشا می باشد که شامل بیماری التهابی، سرطان، تصلب شراین و تخریب بافت عصبی و نورون ها به دلیل تخریب میلین ها است .
پراکسیداسیون لیپید ها در بافت های جانوری در ایجاد بیماری و افزایش سمیت آنها نقش دارد. بافت های تخریب شده (بخصوص تخریب مکانیکی) سریعتر از بافت های سالم دچار پراکسیداسیون می شوند. دلیل افزایش پراکسایش شامل آزاد شدن یون های فلزی و بخصوص آهن، از جایگا های ذخیره ایی داخل سلول و همچنین هیدورلیز پروتئین های فلز دار (METALO PROTEIN) بوسیله آنزیم های پروتئولیتیک آزاد شده از لیزوزوم های آسیب دیده است. در انسان، بیماری ها یا سموم می تواند سبب ایجاد آسیب یا مرگ سلولی شوند که نتیجه آن افزایش پراکسایش لیپیدی است. این آسیب همانگونه که قبلا گفته شد در سیستم عصبی مرکزی (CNS) بیشتر ایجاد می شود. بیشترین مقدار آهن CNS در فریتین وجود دارد و هنگامیکه سلول های مغزی آسیب می بیند مقدار زیادی از آهن آنها به راحتی آزاد می شود.
در اثر پراکسیداسیون لیپیدی غیر اشباع غشا سلول ها رنگدانه هایی به نام لیپوفوسین یا سروئید تشکیل می شود و تجمع اینها در سیتوپلاسم سلول های عصبی افراد مسن مشاهده شده است. این رنگدانه ها اگر با طول موج تحریکی 365 نانومتر تحریک شوند در طول موج 470 دارای نشر خواهند بود(11).
استرس های فیزیولوژیک مثل سرما و کمبود آنتی اکسیدان هایی مانند ویتامین E نیز می تواند سبب ایجاد رنگدانه های لیپوفوسین شود لیپوفوسین علاوه بر ماهیچه و دستگاه عصبی در سیستم های فیزیولوژیک دیگر به طور گسترده مشاهده شده مثلا در بافت های پیوندی پیر باعث تغییرات شدیدی چون کاهش سلول ها و توقف تقسیم سلولی می شود و می توان تصور کرد که عامل اصلی بیماری های ایجاد شده با پراکسیداسیون لیپیدها ایجاد این رنگدانه است.
افزایش محصولات پراکسیداسیون لیپیدی هم در بافت و هم در پلاسما شاخصی برای پراکسیداسیون لیپیدی است. محصوات اولیه شامل لیپید هیدرو پراکساید است که با روش HPLC اندازه گیری می شود ومحصولات ثانویه شامل مالون دی آلدهید، 4HNE و هیدروکربن فعال می باشد. مالون دی آلدهید بیشترین محصول ثانویه تولیدی است که می تواند با گروه های آمین پروتئین واکنش دهد. با تست TBA(تیوباربیتیک اسید ) میزان MDA را در بافت و سرم می توان اندازه گیری کرد که رابطه مستقیم با میزان صدمات پراکسیداسیون دارد(12).4HNE دیگر محصول آلدهیدی اصلی حاصل از پراکسیداسیون لیپید علاوه بر مالون دی آلدهید می باش . 4HNE اثرات قوی بر مسیر انتقال پیام داشته که به نوبه خود اثر اصلی روی صفات فنوتیپی سلول می گذارد. 4HNE یک ترکیب دوگانه است اما ویژگی لیپوفیلی بیشتری دارد. لذا این ترکیب تمایل دارد تا در غشا های زیستی انباشته شود یعنی جایی که فسفولیپید هایی از قبیل فسفوتیدیل اتانول آمین و پروتئین هایی نظیر ناقل، کانال های یونی و گیرنده ها وجود دارند و به سرعت با 4HNE واکنش می دهند(13).
اثر رادیکال های آزاد بر اسید نوکلئیک
گونه فعال اکسیژن (ROS) با حمله به اسید دزوکسی ریبونوکلئیک (DNA) باعث ایجاد اتصالات عرضی بین دو رشته و آسیب به DNA می شود. بطور کلی شکستگی در یک یا دو رشته DNA باعث جهش، آپوپتوز یا مرگ سلولی برنامه ریزی شده، تومور زایی و 000 می شود
در مجموع عوارض اکسیدان و رادیکال های آزاد به صورت بیماری های خطرناکی همانند سرطان، نارسایی قلبی و عروقی، بیماری های مغزی، تحلیل و تضعیف سیستم ایمنی و پیری می شود(14).
با توجه به مطالب فوق بدن موجود زنده به علت عوامل مختلف اکسیدانی در مخاطرات وجود دارد که به شرح آنها می پردازیم.
مکانیسم دفاع آنتی اکسیدانی
تاثیرات مضر گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن به واسطه عملکرد آنتی اکسیدانی، آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی شامل ویتامین C، ویتامین E، کاروتنوئید ها، آنتی اکسیدان های تیولی (گلوتاتیون، تیرودوکسین، اسید لیپوئیک)، فلاونوئید های طبیعی، محصولات هورمونی غده پینه آل، ملاتونین وترکیبات دیگر می باشند(15). بعضی آنتی اکسیدان ها در محیط هیدروفولیک عمل میکنند و برخی دیگر در محیط های هیدروفوبیک و تعدادی در هر دو محیط سلول می کند. برای مثال ویتامین C در فازآبی با سوپراکسید برهمکنش می کند در حالی که ویتامین E در فاز لیپوفیلیک به این شکل عمل میکند. برخی از آنتی اکسیدان ها قادر به تولید مجدد آنتی اکسیدان های دیگر بوده و بنابراین عملکرد اولیه آنها را تجدید میکنند، این فرایند را شبکه آنتی اکسیدانی می نامند(15). با توجه به اینکه موضوع مورد مطالعه در این پژوهش بیشتر معطوف به نقش آنتی اکسیدانی آنزیم پاراکسوناز می باشد به بررسی این آنزیم می پردازیم.
بررسی متون:
پاراکسوناز PON1
پاراکسوناز یکی زا اعضا خانواده سه عضوی PON1، PON2، PON3می باشد. ژن های کد کننده این آنزیم ها مجاور یکدیگر روی بازوی بلند کروموزوم 7 قرار دارند(16). پاراکسوناز سرم انسانی(PON1) یک پروتئین گلیکوزیله از 354 آمینو اسید با وزن مولکولی 43 کیلو دالتون است. بیشتر از 80% تشابه آمینو اسیدی در پروتئین PON1 خرگوش، موش و انسان و حداقل 60% تشابه بین PON1 ، PON2،PON3 در هرکدام از این گونه ها وجود دارد(16).
PON1 ابتدا در پستاندارن شناسایی شد ولی اکنون در مرغ ، ماهی و حتی در بی مهرگان نیز دیده شده است، گرچه فعالیت آن در حشرات ، پرندگان و ماهی ها ناچیز است(17). ژن PON1 در انسان و موش شامل 9 اگزوژن با تقریبا 25 تا 26 کیلو باز می باشد(18). بیش از 200 پلی مورفیسم تک نوکلوئوتیدی به تنهای در ژن PON1 انسانی شناسایی شده است(17). وجود گونه های پلی مورفیک درPON 1 ها نشانگر ارائه نقش های فیزیولوژیک متفاوت توسط آنها است.PON1 ،PON3 در کبد بیان و در خون، جائی که به ذرات HDL متصل می شوند، ترشح می گردند(19)و(20). مقدار PON1 در خون انسان mg/L 50 می باشد(18).PON2 در خون موجود نیست ولی در بعضی از بافت ها از جمله کبد، ریه ها، مغز وقلب بیان می شود(17). خانواده پاراکسوناز یک خانواده هیدرولاز با یکی از وسیعترین ویژگی های شناخته شده می باشد.PON1 نسبت به چندین سوبسترای سنتزی به عنوان یک استراز قوی عمل می کند. در حالی کهPON2 و PON3 تقریبا فعالیت پاراکسونازی نداشته ولی فعالیت لاکتونازی از خود نشان می دهند(17). برایPON ها انواع نقش های فیزیولوژیکی از جمله عمل فسفولیپاز A2 در هیدرولیز فاکتور های فعال کننده پلاکت PAF)) (13) و لیپید های اکسید شده، هیدرولیز و غیر فعال سازی هموسیستئین تیولاکتون، ریسک فاکتور بیماری آترواسکلروز عروقی(21)، پیشنهاد گردیده است از آنجا که ترکیبات هیدرولیز شده توسط پاراکسوناز مانند ارگانوفسفات ها، گاز های عصبی و استر های آروماتیک سوبستراهای غیر فیزیولوژیک هستند، لذا احتمالا این فعالیت ها عملکرد فیزیولوژیکی آنزیم نمی باشند. در تحقیقات اخیر از فعالیت لاکتونازی آنزیم به عنوان فعالیت طبیعی PON 1 نام برده شده است(22) از مطالعات ساختار – فعالیت چنین برمی آید که لاکتون ها سوبسترای ارجح برای PON1 می باشند.
از فعالیت های آنزیماتیک پاراکسوناز انسانی (PON1) می توان به موارد زیر اشاره نمود(17):
هیدرولیز متابولیت های اکسون حشره کش ها مانند پاراکسون
– هیدرولیز گاز های شیمیایی عصبی مانند سارین و سومان
هیدرولیز استرهای آروماتیک مانند فنیل استات
هیدرولیز لاکتون ها و لاکتونیزاسیون هیدروکسی اسید ها مانند هیدروکسی کربوکسیلیک اسید ها
نقش پاراکسوناز (PON1) در انسان
تاکنون نقش آنزیمی پاراکسوناز به طور in vivoمشخص نشده ولی تصور می شود که موجب کاهش اکسیداسیون LDL می گردد. این فرضیه براساس یافته های in vitro شکل گرفت که نشانگر مهار تجمع پراکسید های لیپیدی در LDL توسط آنزیم بود(19). در دیواره شریانی، ذرات LDL اکسید شده توسط رسپتور های مخصوص ox LDL روی ماکروفاژها شناسایی و به درون سلول کشیده می شوند. از آنجا که برای این برداشت هیچ مکانیزم فیدبک منفی وجود ندارد ای پروسه احتمالا به یک انباشتگی (overload) لیپیدی در ماکروفاژ های منجر شده که موجب ترکم لیپیدی و تشکیل یک نوار چرب، شاخص آترو اسکلروز، می گردد. اکسیداسیون LDL یک مرحله کلیدی در پاتوفیزیولوژیکی آترواسکلروز و پیدایش بیماری های قلبی و عروقی به شمار می رود، لذا پارکسوناز به جهت نقش داشتن در کاهش اکسیداسیون LDL بسیار مورد توجه محققان میباشد. جدا از مهار اکسیداسیون LDL، نتایج حاصل از مطالعه روی مدل های in vitro و حیوانی همچنین دلالت بر توانایی پاراکسوناز در جلوگیری از اکسیداسیون HDL و حفظ سلامتی آن دارد (23)و(24). بعلاوه بسیاری از مطالعات ایپدمولوژی آشکار ساخته که آندسته از پلی مورفیسم های موجود در ژن PON1 که مسئول تغییر فعالیت و غلظت آنزیم هستند، در تغییر سطح HDL در جمعیت های مختلف سهیم می باشند(25). از انجا که HDL در بسیاری از فعالیت های حفاظت کنندگی رگ از قبیل برداشت کلسترول اضافی از بافت ها (ترانسپورت معکوس کلسترول ) و مهار پروسه های التهابی شرکت دارد(26)و(27)، لذا محافظت از HDL در مقابل آسیب های اکسیداتیو احتمالا یکی از نقش های مهم پاراکسوناز باشد. مکانیزم فعالیت آنتی اکسیدانی پاراکسوناز شامل هیدرولیز پراکسید های لیپیدی و هیدروپراکسید های کلسترول استر ها می شود.
در خون پاراکسوناز همچنین می تواند سیستئین تیولاکتون، متابولیت هموسیستئین، را هیدرولیز کند. هموسیتئین تیولاکتون با تاثیر منفی بر سنتز پروتئین موجب اختلال در عملکرد اندوتلیال و آسیب رگی می گردد(21)، لذا سم زدایی هموسیستئین تیولاکتون یکی از اعمال محافظتی پاراکسوناز از قلب و رگ های خونی محسوب می شود. کشف جالب دیگر در ارتباط با پاراکسوناز که اهمیت فارماکولوژیک دارد این است که مهار کننده های HMG-CO ردوکتاز (استاتین ها) بر غلظت و بیان ژن PON 1 تاثیر دارند(28)
ساختار کلی پارکسوناز (PON1)
پاراکسوناز دارای یک ساختار six-bladed b propeller است که هر صفحه ان شامل چهار رشته می باشد(16). یک پل دی سولفیدی بین cys 42 و cys 353 وجود دارد(16). این پیوند کوالانت بین N و C ترمینال در b-propeller ها با بیشتر از 4 صفحه بندرت دیده می شود، اما در همه اعضای خانواده PON ها حفظ شده است. دو اتم کلسیم در تونل مرکزی پروانه قرار گرفته اند (Ca1 در نوک و Ca2 در بخش مرکزی تونل ). Ca2 به احتمال قوی یک کلسیم ساختاری است که جدا شدن آن موجب دناتوره شده برگشت ناپذیر می گردد، در حالی که Ca1 شبیه یک کلسیم کاتالیتیک طراحی شده است(33) به نظر می رسد که با این کلسیم 5 رزیدوی پروتئین (اکسیژن های زنجیر جانبی Asn 224، Asn 270، Asn 168،Asn 269 ، Glu53 اینترکشن داشته باشند. دو لیگاند قوی دیگر، یک مولکول آب و یکی از اکسیژن های یون فسفات می باشند(16). دو کلسیم افینیتی های متفاوت نشان می دهد(29). لیگاسیون شدید تر Ca1 و دسترسی بیشتر آن به حلال موجب افینیتی بالاتر Ca2 می گردد.
پاراکسوناز در کریستال بیشتر به فرم منومریک وجود دارد، در حالیه پاراکسوناز محلول در دترژنت، دایمر و الیگومر های بیشتری تشکیل می دهد(30) پاراکسونازی که در سلول های حیوانی بیان می شود گلیکوزیله است(6). گلیکوزیلاسیون برای فعالیت های هیدرولیتیک پاراکسوناز ضروری نیست(31)و(32)، اما ممکن است در افزایش فعالیت حلالیت و پایداری، یا در جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آن به غشا های سلولی (مانند دیگر آنزیم های متصل به HDL) مهم می باشد(33).
چهار جایگاه N –گلیکوزیلاسیون قوی روی پاراکسوناز وجود دارد. دو Asn227 و Asn 270 در تونل مرکزی در پروانه و بسیار غیرقابل دسترس به حلال هستند. درحالیکه Asn 253 و Asn324 روی سطح لوپ ها قرار گرفته اند و به احتمال زیاد جایگاه گلیکوزیلاسیون پاراکسوناز می باشند(16).
شکل 1:
شکل 1: ساختار کلی پاراکسوناز. (A) ساختار six-bladed β-propeller از بالا نشان داده شده است. B)) ساختار پاراکسوناز از یک جانب نشان داده شده است.
خصوصیان آنزیماتیک پاراکسوناز:
نکته جالب توجه در مورد آنزیم پاراکسوناز این است که پروتئین بالغ برای اتصال به HDL ، به پپتید سیگنال N- ترمینال خود نیاز دارد. لذا فقط متیونین ابتدایی آن شکسته می شود(34). آنزیم دارای دو جایگاه اتصال کلسیم با Kd متفاوت می باشد. جایگاه با افینیتی بالاتر برای پایداری و جایگاه دیگر برای فعالیت هیدرولیتیکی آنزیم ضروری می باشند(35). برداشت کلسیم توسط عوامل شلاته کننده فعالیت پایداری پاراکسوناز را از بین می برد، در حالی که بعضی از یون های دو ظرفیتی مثل روی، منگنز و منیزیم پاراکسوناز را پایدار، گرچه غیر فعال نگه می دارند(35). پاراکسوناز سه رزیدوی سیستئین در موقعیت های 42، 284 و 353 دارد که اولی و سومی یک پل دی سولفیدی تشکیل داده ولی سیستئین 284 آزاد است(29). جهش زایی در C42 وC35 به آلانین، منجر به غیر فعال شدن پاراکسوناز و کاهش قابل توجه ترشح آن می شود(31). موتاسیون C284 به آلانین یا سرین فعالیت های پاراکسونازی و آریل استرازی را کاهش داده ولی ازبین نمی برد(36). در مقابل، وجود کلسیم برای پاراکسوناز در محافظت از LDL در برابر اکسیداسیون در برابر مس ضروری نیست، درحالیکه وجود C284 برای این ویژگی مورد نیاز می باشد (23) حصول این داده ها منجر به ارائه فرضیه ای شد که معتقد است پاراکسوناز دارای دو جایگاه کاتالیتیک است یک جایگاه جهت فعالیت های هیدرولیتیک و جایگاه فعالیت آنتی اکسیدانی(23).



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید