دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده علوم پایه
پايان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست فناوری
گرایش میکروبی
عنوان
تهیه کونژوگه پلی ساکارید PRP هموفیلوس آنفلوآنزا تیپ b با اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا و سنجش ایمنی زایی آن در مدل حيواني
استاد راهنما
دکتر حجت احمدی
استاد مشاور
دکتر مهدی نجاتی
نگارنده
محمد ابراهیمی
شهریور 1393
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15
مقدمه
هموفیلوس آنفولانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17
میکروبیولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………19
دسته‌بندی سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا قابل تیپ بندی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20
کلون سازی و تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1-2-4 کلون‌سازی در مجرای تنفسی فوقانی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………22
1-3-4 حمله به اپیتلیوم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23
1-4-4 حمله به جریان خون…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………24
1-5-4 بقا در جریان خون…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..25
1-6-4 حمله به CNS……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….26
1-1-5 شاخص‌های بیماری زایی هموفیلوس آنفولانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….27
1-2-5 OMPs…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28
1-3-5- پیلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
1-4-5- ایمونوگلوبولین A1 پروتئاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………30
1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..31
1-6-5- نقش LPS در بیماری‌زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………32
1-1-6 کپسول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….34
1-2-6- دخالت کپسول در بیماری‌زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….36
1-3-6- ژنتیک بیان کپسول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………36
1-1-8 روشها و آزمونهای تشخیص آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
1-2-8 روشهای تشخیص کلاسیک…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….39
1-4-8- برتری روشهای تشخیص مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………40
1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….40
1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………44
1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
2-1 واکسن های کونژوگه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48
2-2- واکسن‌های Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49
2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..50
2-4- پاسخ های واکسن پلی‌ساکاریدی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..51
2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی……………………………………………………………………………………….51
2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..51
2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-5-3- مولکول های حامل ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-6-EDC یا EDAC………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………52
2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………53
2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن1 – حامل……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55
2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
2-11- سنجش فعاليت باكتري كشي………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56
فصل سوم- مواد و روش ها
3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
3-2-1- تهيه ميكروارگانيسم هاي به كار گرفته شده در اين مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….66
3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b ليوفيليزه و کشت آن…………………………………………………………………………………………………66
3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….66
3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66
3-2-5-تیمار عصاره مخمر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………67
3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70
3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72
3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..73
3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….73
3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74
3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………74
3-2-12- افزودن فسفات سدیم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………75
3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..75
3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….75
3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..76
3-2-16- لیوفلیزاسیون ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..76
3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….76
3-2-18- تست ریبوز …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………76
3-2-18- 1- اساس تست بیال ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….77
3-2-18- 2- معرف‌های تست بیال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….77
3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
3-2-18- 4-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..77
3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….79
3-3-1- آزمون هاي پروتئين سنجي ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79
3-3-2روش برادفورد ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………81
3-3-3- روش پروتئين سنجي Lowry …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..81
3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….83
3-5- سنجش نوکلئیک اسید ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………83
3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژينوزا PA103 …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
3-6-1- طرز باز كردن سوش ليوفيليزه جديد …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
3-6-2-تهيه لوله بذر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..84
3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………85
3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….85
3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………85
3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..87
3-6-8- رسوب با سولفات آمونيوم ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..87
3-6-9- دياليز اگزوتوكسين A …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..88
3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسين A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89
3-16-2-1مواد مورد نیاز: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….89
3-6-11سنجش توليد اگزوتوكسين A ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….89
3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………90
3-6-12- دتوكسيفاي كردن اگزوتوكسين A به روش فرمآلدیئد …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..91
3-7- ژل فيلتراسيون جهت تخليص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-9- سنجش پروتئین …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93
3-12- كنترل توكسيسيته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94
3-13- آزمون پیروژنی ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94
3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94
3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94
3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94
3-16- پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز درحضور سديم دو دسيل سولفات(SDS-PAGE) ………………………………………………………..96
3-16-1- اصول روش SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96
3-16-3- محلولهاي مورد نياز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97
3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97
3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98
3-16-6-رنگ آميزي ژل پلي آكريل آميد ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99
3-16-7- محلولهاي مورد نياز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100
3-16-8- روش رنگ آميزي …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101
3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA1) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101
3-17-1- اصول آزمون SBA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101
3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101
3-17-3-روش انجام آزمون ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102
فصل چهارم: نتایج
4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107
4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108
4-3- تعیین خلوص PRP ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109
4-4- اندازه‌گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111
4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و ETA و PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113
4-6- کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113
4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114
4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115
4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115
4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116
4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116
4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117
4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشي سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- واکسن‌های کونژوگه‌ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124
5-2- واکسن کونژوگه‌ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125
5-3- واکسن کونژوگه‌ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125
5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126
5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127
5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128
نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129
پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129
منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130
.
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19
شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20
شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%) 362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41
شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67
شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70
شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71
شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72
شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74
شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78
شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونيوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88
شکل 3-8 دياليز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89
شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107
شکل 4-2 تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107
شکل 4-3 طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110
شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111
شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116
شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117
فهرست جدول ها و نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1نمودار استاندارد لوري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83
جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108
نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-3 تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110
جدول 4-2 تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
جدول 5-3- میزان ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….112
نمودار 5-5- منحنی استاندارد پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 4-4- میزان پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 5-4- میزان اسید نوکلئیک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..114
نمودار 4-6-منحنی OD فرکشن های کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115
جدول 4-5- عیـار آنتی بادی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….118
جدول 4-6- تيتر آنتي بادي باكتري كشی واكسن کونژوگه (PRP-ETA) و PRP در روزهای 15،30، 45…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….119
چكيده
هموفیلوس آنفلوانزا سروتیپ b مهمترین عامل مننژیت و پنومونی در کودکان زیر 5 سال در سراسر جهان می باشد که پس از کلونیزه شدن در حلق وارد خون شده و باکتریمی می دهد،در ادامه باکتری از طریق خون خود را به مننژ رسانده و مننژیت می دهد که عامل 95% باکتریمی و مننژیت ها هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b می باشد که از کپسول پلی ساکاریدی آن موسوم به پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP) جهت تولید واکسن های کونژوگه گلیکوپروتئینی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b استفاده شده است.به دلیل اینکه پاسخ ایمنی نسبت به این پلی ساکارید غیر وابسته به سلول T بوده و در پاسخ ایمنی سلول خاطره ایجاد نمی گردد،لذا دوز یادآور تاثیری در بالا بردن سطح ایمنی ندارد.برای از بین بردن خاصیت T-INDEPENDT،PRP به طور کوالانسی به اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا (ETA) متصل می گردد.در این پروژه سویه استانانداردهموفیلوس آنفلونزا سروتیپ b ابتدا در فرمانتور حاوی محیط CY (کازآمینواسید – عصاره مخمر )کشت گردید و تخلیص PRP از مایع کشت با انجام روش های الکل پرسپیتاسیون (رسوب دادن الکلی) و رسوب دادن با ستاولن (هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید)،التراساتریفیوژ و تخلیص با هیدروکسی آپاتیت حاصل گردید.جهت تهیه اگزوتوکسین A نیز سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت تریپتیکازسوی براث کشت گردید و پس از سنجش توکسیسیته در موش با استفاده از روش قلیایی ،سم زدایی شده و جهت کونژوگه نمودن با PRP از ADHو سیانوژن بروماید به عنوان اسپیسر و EDAC به عنوان عامل لینکر استفاده گردید و کونژوگه حاصل با عبور از ستون CL-4B تخلیص شد.
کونژوگه بدست آمده جهت ارزیابی ایمونولوژیکی طی 2 مرحله با فاصله 14 روز به تعدای خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق گردید و از هر کدام از خرگوش ها در روزهای 0،15،30،45 خونگیری از قلب انجام شد.تیتر آنتی بادی توسط سرم باکتریسیدال اسی اندازه گیری شد.تیتر باکتری کشی برای PRP خالص در تزریق اول 16 و در تزریق دوم شاهد افزایش تیتر نبودیم.تیتر باکتری کشی برای کونژوگه در تزریق اول 32 و در تزریق دوم 64 بود که شاهد افزایش تیتر بودیم.با توجه به نتایج حاصل شده ،کونژوگه PRP-ETA سبب تحریک بیشتر سیستم ایمنی و افزایش تیتر آنتی بادی در تزریق دوم می گردد.همچنین اگزوتوکسین A دتوکسیفای شده یک کریر مناسب می باشد.
کلید واژه:
هموفیلوس آنفلونزا تیپ b، سودوموناس آئروژینوزا،واکسن کونژوگه، پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP)، اگزوتوکسین A
مقدمه
1-1-1 هموفیلوس آنفولانزا
هموفیلوس آنفولانزا یک باکتری گرم منفی است که اولین بار توسط Pfeiffer در سال 1982 توصیف شد.( پیفر،19822 ) این که هموفیلوس آنفلوآنزا انگل مخصوص انسان میباشد باعث شد که این تصور بوجود بیاید که این باکتری عامل اصلی آنفلوانزا میباشد. در هر حال از کالبدشناسی افرادی که مبتلا به حمله ناگهانی (به صورت تکگیر) در طی پاندمی آنفلوآنزا در سال 1918 شدهبودند، هموفیلوس آنفلوآنزا دیده نشد.Pittman کشف کرد که سویههایی از این باکتری میتوانند در دو گروه کپسول دار (قابل تیپبندی) و بدون کپسول (غیر قابل تیپبندی) تقسیم بشوند( پیتمن،31931 ). Pittman بیشتر توانست نشان بدهد که شش تیپ هموفیلوس آنفلوآنزا بوسیله سرولوژی اختصاصی کپسولشان از a-f قابل تیپبندی هستند. به طور عمده سویه تیپ (Hib) b باعث حملات اصلی بیماری از جمله: مننژیت و سپتیسمیا و به دنبال آن اپیگلوتیت، سلولیت، آرتریتسپتیک، پنومونی میشوند(آلکساندر، 41965). سویه بدون کپسول (غیر قابل تیپبندی) منجر به: اوتیت مدیا، سینوسیت و عفونت حاد دستگاه تنفسی تحتانی میشود.بیشترین احتمال آلودگی به بیماری مرتبط با هموفیلوس آنفلوآنزا، کودکان بین سنین 10 تا 16 ماه هستند و اخیراً به عامل اصلی میلیونها مرگ در کشورهای در حال توسعه تبدیل شدهاست. در طی این زمان، کودکان به طور کامل بوسیله سیستم محافظتی آنتیبادی محافظت نمیشوند و همچنین در سرمشان آنتیبادیهای توسعه یافته وجود ندارد (فاترگیل و همکاران،51933) جلب توجه بیماریزایی عفونت هموفیلوس آنفلوآنزا با ورود شیمی درمانی توسط مواد آنتیمیکروبیال کاهش پیدا کرد. با این وجود مرگ و میر ناشی از مننژیت که بوسیله هموفیلوس آنفلوآنزا در آمریکای شمالی در سال 1930 ایجاد شد تقریباً در 100% از موارد مبتلا بود(تیلر وهمکاران،19906). با ظهور آنتیبیوتیکها مرگ و میر در اواسط سال 1960 به 10-5% کاهش پیدا کرد(هاگرتی وهمکاران،19647- ترک وهمکاران،19678) به هر حال، در کمتر از 30% از افراد زندهمانده نقص جدی همانند: اختلال در بینایی، شنوایی، حمله ناگهانی بیماری و زوال عقل دیده می شد.(اسپرولس وهمکاران،19699 ،کروک و همکاران،194910)در طی سال 1970، مقاومت آنتیبیوتیکی سویههای Hib منجر به تکثیر و گسترش آنها شد. در سال 1991 تخمین زده شد که 11% از سویههای خالص شده هموفیلوس آنفلولآنزا تیپ b نسبت به آمپی سیلین و همچنین بیشتر آنتی بیوتیکهای معمول که برای درمان آلودگی به این ارگانیسم استفاده میشد، مقاومت دارند.(بوی وهمکاران،199111). Jenner و همگارانش مقاومت فوقالعاده و غیرمنتظره سویههای هموفیلوس آنفلوآنزا را به کلرومنفنیکل در سال 1990 گزارش کردند. (جنر و همکاران،199012) بیماریزایی هموفیلوس آنفلوآنزا فقط تنها موضوع اصلی در مورد این باکتری نبود، بلکه موضوع ژنتیک بنیادی و تحقیقات مولکولی نیز مطرح بود. در اوایل 1950، هموفیلوس آنفلوآنزا به عنوان دومین نمونه بعد از پنوموکوکوس به عنوان یک ارگانیسم قابل ترنسفورم شدن شناسایی شد. سپس در اواخر 1960، Hamilton smith روی نوترکیبی همولوکوس در هموفیلوس آنفلوآنزا تحقیق کرد، که این تحقیقات به طور مستقیم منجر به کشف تیپ II آنزیمهای اندونوکلئازی محدود کننده شد، که این آنزیم در تکنولوژی DNA نوترکیب بسیار مورد استفاده قرار گرفت. تحقیقات مولکولی و ایمونولوژیکی برروی کپسول پلیساکاریدی فوکوس پیدا کرد که بعدها منجر به توسعه و تجارت و انتشار اولین واکسنهای پلیساکاریدی- کونژوگه در سال 1989 شد. در سال 1995 هموفیلوس آنفلوآنزا اولین باکتری آزادزی بود که ژنومش به طور کامل سکانسبندی شد(فلیچمن،199513). این کار بزرگ بسیار قابل توجه بود و باعث شد که سکانسبندی ژنوم بسیاری دیگر از باکتریها آغاز شود و استفاده از ژنوم و بیوانفوزماتیک در تحقیقات میکروبیولوژی شروع شود .
شکل 1-1
کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار
1-1-2 میکروبیولوژی
هموفیلوس متعلق است به خانواده پاستورولاسه که دو جنس دیگر به نام های پاستورولا و اکتینوباسیلوس نیز دارد.این باکتری متعلق به این خانواده کوکوباسیل‌های غیراسپور کوچک هستند که نیازهای رشدی مخصوصی دارند و اغلب برای خالص‌سازی به محیط کشت غنی شده نیاز دارند. اسم جنس، هموفیلوس (به معنای دوستدار خون) وابستگی ویژه‌ی این ارگانیسم به مولکول‌های مربوط به خون برای رشد تحت شرایط هوازی مربوط است. مورفولوژی هموفیلوس آنفولانزا در نمونه‌های بالینی از کوکوباسیل ها تا رشته‌های دراز متغیر است. (دیویس و همکاران،197314)

شکل (2-1) هموفیلوس آنفلوانزا
1-1-3 دسته‌بندی سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا قابل تیپ بندی :
یافته های حاصل از اپیدمیولوژی بیماری های هموفیلوس آنفلوآنزای تیپ بندی شده منجر به جستجوی مقدماتی برای سیستم نشانگر تبعیضی بین سویه ها شد. در اوایل 1980، ایزوله های کلینیکی Hib براساس تفاوت در الگوی تحرک الکتروفورنیک پروتئین های خارج غشائی بزرگ(omps) و لیپوپلی ساکارید(lps) کلاس بندی شدند(بارن کمپ و همکاران،198115، اینزا و همکاران،198416). سویه های Hib به یکی از چهار گروه براساس واکنششان با آنتی بادی مونوکلونال اختصاص lps تقسیم شدند.
Musser و همکاران تلاش کردند تا تنوع ژنتیکی و روابط تکاملی بین نژادهای هموفیولوس را بسنجند. (موسر وهمکاران،199017 و موسرو همکاران 1985). سویه ها بوسیله الکتروفوز آنزیم های چندکانونی (MLEE) که در آن چند شکلی آنزیم‌های متابولیک ضروری برای برآورد واگرایی از یک نیای مشترک فرضی مورد استفاده قرار می‌گیرد، دسته بندی شدند. در طول زمان، ژن‌های کد کننده آنزیم‌های متابولیک ضروری، متحمل جهش‌های طبیعی می‌شوند.. 177 سویهی تیپ b، از خون یا مایع مغزی- نخاعی کودکان آمریکای شمالی خالص شد و در داخل چندین گروه با تفاوتهای ژنتیکی یا تیپ های الکتروفورزیس قرار گرفت. هر کدام تعدادی آلل های همراه غیر تصادفی را نشان می دادند.( موسرو همکاران 1985) سویه هایی که تطابق یا شباهت زیاد از نظر ETS داشتند از نواحی مختلف جغرافیای بدست آمدند و این نتیجه نشان داد که یک خویشاوند کلونال بین سویه های تیپ b وجود دارد و نتیجه مهمتر اینکه سویه هایی که باعث بیماری های تهاجمی می شدند از نظر تنوع ژنتیکی دارای محدودیت بودند. بعلاوه اینکه بیشتر ایزولهای آمریکای شمالی به دو سویه نزدیک از نظر ETS متعلق بودند و متفاوت بودند با سویه هایی که از کشورهای مختلف اروپایی جمع آوری شده بودند(اروین و همکاران 199518). این یافته های یک آلودگی اپیدمیولوژیک را پیشنهاد کرد در حالی که کلونهای تیپ b موفق شدند از میان یک جمعیت به میان جمعیت میزبان دیگر متمایل شوند و باعث یک هایپراندمیک در بیش از یک دوره در سال بشوند و این تغییرات تقریباً شبیه به تغییراتی بود که در نیسر یا مننژیتیس اتفاق افتاد(جونز و همکاران،199819 و کوگانت،199820). اخیراً کاربرد تکنیک‌هایی مانند مولتی لوکوس سکونس تایپینگ (MLST)، ریبوتایپینگ و توالی‌یابی RNA، تفاوت‌های اساسی را بین نژادهای قابل تیپ بندی و غیر قابل تیپ بندی هموفیلوس آنفولانزا آشکار کرده است.
1-1-4 کلون سازی و تهاجم :
بیماری‌زایی هموفیلوس به وسیله‌ی مطالعات موردی و با استفاده از جانوران و مدل‌های عفونی invitro بررسی شده است. بررسی هموفیلوس آنفولانزا مثال خوبی برای فهم بیماری‌زایی باکتریایی به صورت کلّی بوده است. چندین مرحله مجزا برای تهاجم هموفیلوس تشخیص داده شده است.
1-2-4 کلون‌سازی در مجرای تنفسی فوقانی
هموفیلوس آنفلوآنزا به طور معمول در سطح مولکولی دستگاه تنفسی انسان و گهگاه در دستگاه ژنیتال زنان مستقر می شود(گیلسدروف و همکاران،199721). در بچه ها احتمال مستقر شدن باکتری نسبت به افراد بالغ بیشتر است. تقریباً 5% از اشخاص سالم سروتایپهای a-f را دارا می باشند (ترک،1994). از نازوفارنکس، ارگانیسم از یک شخص به شخص دیگری بوسیله ی قطرات هوا یا انتقال مستقیم (بوسیله ی ترشحات) انتقال پیدا می کند.(فارلی و همکاران،199222) واکنش اولیه بین هموفیلوس و انسان در کشت بافت انسان که حد واسطی بود برای اتصال باکتری به ماده بزاقی نشان داده شد(ردی و همکاران،1996 23و دیویس و همکاران،199524). در سیستم های کشت در invitro مانند سلولهای اپی تلیال (oropharyhgeal) نشان داده شد که پیلی یک حد واسط برای اتصال می باشد، پس بنابراین برای جلوگیری از اتصال باکتری به سلول انسان پیلی مورد هدف محققان قرار گرفت (پیچیچیرو و هکگاران،198225- گورینا و همکاران 261982) بعدها گزارش شد که هموفیلوس هایی که فاقد پیلی هستند نیز به میزان قابل ملاحظه ای توسط پروتئین های غشای خارجی (omps) به سلولهای پستانداران متصل می شوند.(جیم و همکاران،199027 و فارلی و همکاران،1990). آنها بوسیله میکروسکوپ الکترونی (TEN) نشان دادند که هم Hib هایی که دارای پیلی بودند و هم Hib هایی که فاقد پیلی بودند هر دو به طور انتخابی به سلولهای اپی تلیال غیر مژه دار متصل می شوند(فارلی و همکاران،1990). اخیراً گزارش شده که گانگلوزوئیدهای اختصاصی (سالیتد گلیکواسفنگولیپید) از سلولهای اپی تلیال تنفسی انسان و ماکروفاژهایی که رسپتور برای هموفیلوس آنفلوآنزا دارند سلولهای مناسبی برای اتصال باکتری می باشند.(فکیح و همکاران،199728) محققان متوجه شدند که هموفیلوس آنفلوآنزا برای مدت زیادی می تواند در داخل سلول زنده بماند. این یافته یک نتیجه گیری مهم را در برداشت، و آن اینکه، معلوم شد که زنده ماندن باکتری در داخل سلول، ریشه کنی آنرا به وسیله آنتی میکروبیالها دچار مشکل می کند(سادنبرگ و همکاران،198429) مگر اینکه از عواملی که در داخل سلولهای انسانی فعال هستند مانند ریفامپیسن و quinolones استفاده شود. در مطالعات invitro توانایی زنده ماندن هموفیلوس آنفلوآنزا در داخل سلولهای اپی تلیال و ماکروفاژها به اثبات رسید.(ویلیامز و همکاران،199130،نوئل و همکاران،199431)
1-3-4 حمله به اپیتلیوم
درسیستم کشت درinvitro، مشخص شد که سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا یک گرایش شدید به موکوس دارند که این گرایش منجر به در هم ریختن اتصالات محکم سلولهای اپی تلیال می شود که نتیجه این بی نظمی ریزش سلولهای مژه دار و ciliostasis است(جکسون و همکاران،199632، جانسون و همکاران،198633، فارلی و همکاران،1992). از این گذشته، آسیب به سلولهای اپی تلیال منجر به در معرض گذاشتن سلولهای بازال لایه های سطحی زیرین و غشاهای زیرین می شود. این روند امکان گسترش عفونت به بافت های دیگر را فراهم می کند.( فارلی و همکاران،1992) نکته جالب توجه اینکه که این باکتری تمایل زیادی به این سلولها نسبت به سلولهای اپی تلیال سالم دارد.(هوود و همکاران199034،جیم و همکاران،1990).
1-4-4 حمله به جریان خون
تا اواخر دهه 1970 مشخص نبود که انتقال هموفیلوس آنفولانزا به سیستم عصبی مرکزی (CNS) از طریق گسترش از نازوفارنکس به همراه رشته های عصبی حس بویایی اتفاق می افتد یا طریق مسیر خونی. برای بررسی این مسئله، نژادهابی مشابه هموفیلوس که مقاومت آنتی‌بیوتیکی متفاوت داشتند به داخل بینی موش ها تلقیح شدند یک نژاد در خون و مایع مغزی نخائی (CSF) تشخیص داده شد(ماکسون و همکاران 197835) که نشان دهنده‌ی مسیر خونی برای این ارگانیسم بود. به علاوه، ظهور مننژیت بعد از تلقیح درون بینی، در موش‌های صحرایی نشان‌دهنده ارتبط مستقیم با شدت باکتری بود(ماکسون و همکاران 1977).
بررسی‌های دقیق میانکنش مستقیم بین هموفیلوس آنفولانزا و سلول‌های اندوتلیال با استفاده از مدل سلول‌های اندوتلیال سیاهرگری نافی انسانی، انجام شد. با استفاده از TEM، بلع فاگوسیتوزی این ارگانیسم به وسیله این سلول‌ها آشکار سازی شد(ویرجی و همکاران،199136). این مطالعه نشان داد که این ارگانیسم، بعد از ورود، درون واکوئول‌های سلول‌های اندوتلیال زنده می‌ماند و سپس به درون تمامی واکوئول‌های درون سلول منتقل می‌شود و در سطح دیگر سلول ظاهر می‌شود.
همانطور که برای اولین بار Rubin و Moxom گزارش دادند، اکنون پذیرفته شده است که هموفیلوس آنفولانزا از طریق حمله مستقیم به مویرگ‌های تغذیه‌کننده‌ی بافت اپیتلیال، از بافت زیر اپیتلیالی به جریان خون گذر می‌کند.(روبین و همکاران،198337)
1-5-4 بقا در جریان خون
پاسخ ایمنی ذاتی و اکتسابی در جریان خون میزبان بر علیه باکتری به وجود می آید و این در حالی است که باکتری برای به وجود آوردن آلودگی و بیماری بایستی تداوم داشته و زنده بماند.
نشان داده شد که بیش از 90% از جمعیت باکتری های تلقیح شده به داخل روده (ir) موش در چند دقیقه از بین رفته اند(ماکسون و همکاران،1981).
جالب اینکه سویه هایی که از سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی فرار کرده اند و تداوم داشتند، به میزان زیادی، به مننژ موش حمله کرده و بیماری مننژیت را ایجاد کرده اند(نوئل و همکاران،1990).
فاکتورهایی که به حیات زیر جمعیت ها یا گونه های مختلف از هموفیلوس آنفلوآنزا در جریان خون کمک می کند بعداً به طور کامل مورد بحث قرار می گیرند.
پاکسازی هموفیلوس آنفلوآنزای کپسول دار از خون مستلزم نشستن فاکتور c3 روی باکتری می باشد، که این عمل مستقل از ترکیبات مکمل بعدی نظیر c5- c9 می باشد. در صورتی که فاکتور c3 برروی باکتری بنشیند، باکتری به دنبال فاگوسیتوز ماکروفاژها از جریان خون خارج می شود.
کپسول تیپ b از اتصال ابتدائی c3 جلوگیری می کند و بدین ترتیب هضم باکتری بوسیله ی سلولها فاگویست را کاهش می دهد(نوئل و همکاران،1990)
کپسول تیپ b به طور آشکارا نسبت به دیگر تیپ های کپسول دار این باکتری در جلوگیری کردن از فاگوسیتوز ماکروفاژها، مؤثرتر عمل کرده و این توانایی بزرگی بشمار می آید و به تیپ b در افزایش میزان بیماری نسبت به تیپ های دیگر برتری می بخشد.
1-6-4 حمله به CNS
اعتقاد براین است که میانکنش اصلی بین هموفیلوس آنفلوآنزا و سدخونی- مغزی (BBB) اتفاق می افتد.
BBB تک لایه ای است که سلولهای اندوتلیال را متمایز می کند و اینکه مسئولیت اصلی آن نگه داشتن پایداری مواد بیوشیمایی در داخل CNS می باشد(بتز و همکاران،198638). در سلولهای اندوتلیال اتصالات محکم پیوسته و تعداد کمی مشخصه(علامت) پینوسیتوز وجود دارد(پاتریک و همکاران ،199239). از میانکنش بین هموفیلوس آنفلوآنزا و BBB در مدل invivo مثل مننژیت در نوزاد موش و همچنین در مدل های invivo مثل سلولهای اندوتلیال گاو، توانستند اطلاعات مقدماتی مفیدی بدست آورند(کواگلیارلو و همکاران،1986). این مدلها نشان می دهد که هموفیلوس آنفلوآنزا به BBB متصل می شود و سپس از وسط یا بین سلولهای بافت پوششی به داخل CSF تغییر مکان می دهد. در Hib, rat زنده یا کشته شده به وسیله گرما پینوسیتوز را افزایش می دهد و بدین ترتیب اتصالات محکم بین اندوتلیال ها را در هم می ریزد(کواگلیارلو و همکاران،198640،ویسپلوی و همکاران،198841). آسیب به BBB و ورود هموفیلوس آنفلوآنزا را به داخل CSF تسهیل می کند. به یکباره در CSF، جمعیت هموفیلوس آنفلوآنزا ممکن است به طور پیوسته زیاد شود و به دنبال آن مننژ مغز را آلوده کند و بیماری مننژیت را سبب شوند.
1-1-5 شاخص‌های بیماری زایی هموفیلوس آنفولانزا
به نظر می‌رسد که هر مرحله از بیماری‌زایی و عفونت‌ هموفیلوس آنفولانزا وابسته به بیان مجموعه‌ای از چندین شاخص بیماری‌زایی است، این شاخص‌ها عبارتند از: پروتئین‌های غشای خارجی (OMPs)، مژک‌ها، پروتئازهای IgA1، لیپوپلی‌ساکارید و کپسول، که تعدادی از این شاخص‌های بیماری‌زایی در موش‌های صحرایی و انسان،(بارن کمپ و همکاران،1981، کیمورا و همکاران 198542،گرین و همکاران،199043) سبب ایجاد پاسخ ایمنی به هموفیلوس آنفولانزا می‌شوند و در بین نژادهای این ارگانیسم، نسبتاً حفاظت شده‌اند.(نلسون و همکاران،199144،اروین و همکاران،1984) از این رو آنها به عنوان نامزدهای واکسن‌ در مقابل بیماری ایجاد شده به وسیله‌ی هموفیلوس بررسی شده‌اند(مونسن و همکاران 198545،کیمورا و همکاران 1985).
1-2-5 OMPs
سویه های هموفیلوس آنفلوآنزا بین 10 تا 20، omps در سایزهایی از 16 تا 98 kda (و بیشتر) را بیان می کند(مرفی و همکاران ،198346). تعداد زیادی از omp ها پروتئین پورین و p2 می باشند.(لوئب و همکاران،198147،کالتن و همکاران 198348) و از گزارشات جمعی آوری شده این نتیجه بدست آمده که p2 یکی از عواملی است که در ویرولانس Hib شرکت می کند. در موتانت های ایزوژنتیک از سویه های بیماری زای Hib، این نتیجه بدست آمده که جلوگیری از سنتزp2 ویرولانس را در نوزادان موش کاهش می دهد(کپه و همکاران،1990). پروتئین p2 متقابلا با lps عمل می کند(گولیج و همکاران،198549). پروتئین p5 به هر جهت یکی از عوامل مسئول در تهاجم به اپی تلیال موکوس می باشد و این اثر به دنبال غیر فعال کردن ژنp5، که نتیجه اش کاهش در باکتریها به دنبال تلقیح داخل بینی به نوزادان موش می باشد، درک شده است(چان یان گام و همکاران،199150) . P6 و 98k omp نشان داده شده که ایمونوژن هستند در انسان و anti- 98k , anti-p6 آنتی بادی های محافظت کننده در نوزادان موش در مقابل هموفیلوس آنفلوآنزا است(گرین و همکاران،1990و کیمورا و همکاران 1985).
1-3-5- پیلی
پیلی هموفیلوس آنفلوآنزا 0/18- 7/4 نانومتر قطر و بین 209 و 453 نانومتر طول دارد و همچنین دارای یک مرکز توخالی می باشد(مانسون و همکاران1985-استول و همکاران،198451). پیلی هموفیلوس آنفلوآنزا بصورت پری ترپکوس می باشد و مشخص شده که پیلی حد واسط اتصال باکتری به سطح موکوز است و از اینرو باکتری به راحتی در دستگاه تنفسی مستقر می شود. اندرسون و همکارانش مشاهده کردند که سویه های هموفیلوس پیلی دار اتصال قویتری نسبت به واریانتهای بدون پیلی شان به سلولهای اپتلیال دهان به دنبال تلقیح باکتری دارند.(اندرسون و همکاران،1985). بعدها به دنبال تلقیح هر دو نوع باکتری پیلی دار و غیر پیلی دار به وسیله روش ip یا iv به موش نشان داده شده که سویه های پیلی دار نسبت به سویه های بدون پیلی باکتریمای کمتری را ایجاد می کنند(گوتیرز و همکاران 199052) و این به این دلیل است که هموفیلوس های پیلی دار تحریک اپسونیزاسیون وابسته به فاگوسیتوزیس بوسیله ی سلولهای نوترفیل را تسهیل می کنند(توسی و همکاران ،198553). از گفته های بالا به این نتیجه می رسیم که بیان پیلی در طی مرحله استقرار بیماری برای باکتری مهم و مفید است اما در طی مراحل خونی و سیستمیک برای باکتری زیان آور است. بیان پیلی در هموفیلوس آنفلوآنزا شبیه دیگر ارگانیسم ها، قابل تغییر است و امکان بوجود آمدن یک پیلی جدید با تفاوت آنتی ژنی با پیلی قبلی وجود دارد(کروگفلت،199154). توافق شده که در یک کپی از لوکوس پیلین، ژن hifA و hifE هست و این لوکوس در تمامی سویه های هموفیلوس موردمطالعه به جزء سویه Rd وجود دارد. تمام سکانس ژنومی این سویه سکونسینگ شده و اینکه سایز آن در حد 1/8Mb است(فلیچمن و همکاران،1995) که 0.3Mb کوچکتر از سویه پاتوژن نمونه ی اولیه می باشد. مشخص شده که ژن hifA باعث کد شدن زیر واحدهای بزرگ پیلی می شود و ژن hifB، چاپرون پیلوس را کد می کند(در واقع پوشاننده توالی تکرار دو نوکلئوتیدی می باشد). مکان این توالی دو نوکلئوتیدی بین ناحیه ی10- و 35- می باشد(ون هام و همکاران،199355). در واقع ما در این توالی، تکرار توالی دو نوکلئوئیدی TA را به وفور می بینیم و تغییر در این توالی باعث عدم کفایت اتصال RNA پلی مر از به پروموتور شده و در پی بردن به اینکه سویه های دارای پیلی تهاجمی تر می باشند یا سویه های غیر پیلی دار با دگرگون کردن توالی تکرار TA ممکن شد.(ملانگا و همکارن،1998 56 ) همانطور که گفته شد تغییر در این توالی باعث عدم رونویسی می شود و بدین ترتیب سویه بدون پیلی می شود و سپس این امر مسلم شد که سویه های غیر پیلی دار نسبت به سویه های پیلی دار تهاجمی تر می باشند(فارلی و همکاران،1990).
1-4-5- ایمونوگلوبولین A1 پروتئاز
ایمونوگلوبولین A1 پروتئاز ترکیبی است که به وسیله یک شماری از پاتوژنهای موکوسی ترشح می شود. این پاتوژنها شامل: نیسریا مننژیتیدیس، نایسر یا گونه روآ، استرپتوکوکوس پنومونیه و نیز هموفیلوس آنفولانزا است(پولنر و همکاران،198757،پولسن و همکاران،1989 58). IgA1 پروتئاز هموفیلوس آنزیم‌های نوع سرینی هستند که به صورت پروتئین‌های 169 کیلودالتنونی سنتز می‌شوند (پولنر و همکاران،1987،کلاسور و همکاران ،199359). فعالیت IgA1 پروتئاز تجزیه و غیر فعال سازی IgA1، آنتی بادی غالب ترشحی در دستگاه تنفسی فوقانی است(کیلیان و همکاران،199660) و باور بر این است که این پروتئازها، سبب تسهیل کلونیزه کردن می‌شوند(پلات و همکاران،198361). IgA1 پروتئازها به طور ویژه یکی از 4 پیوند پپتیدی قرار گرفته درون یک توالی آمینو اسیدی محدود، از ناحیه‌ی لولای زنجیره‌ی آلفای IgA1 انسانی، شامل فرم ترشحی (S-IgA1) را می‌شکنند. سپس مولکول‌های به صورت قطعات Fab مونومری سالم، از بخش FC جدا می‌شوند که معمولا مسئول ویژگی‌های حفاظتی این عامل ایمنی است(کیلیان و همکاران،1988) . در هنگام شکست، دمین C-terminal 50 کیلودالتونی پروتئاز IgA1 در غشای خارجی باکتری باقی می‌ماند، در حالی N-terminal دارای فعالیت پروتئولیتیک ترشح می‌شود. برای هموفیلوس آنفولانزا حداقل دو کلاس پروتئاز IgA1 بر اساس شکست در یوند proly1-sery1 (شناسایی تیپ I) یا چهار آمینواسید آن طرف‌تر، در پیوند proly1ـthreory1 (نوع 2) تعریف شده است(بریکر و همکاران،198562،گروندی و همکاران،199063). این پروتئین‌ها، علاوه بر تفاوت در ویژگی شکست، پلی مورفیسم و تنوع آنتی‌ژن قابل توجهی نشان می‌دهند، به طوری که بیش از 30 نوع از این پروتئازها، بر اساس پاسخ‌های سرولوژیک در انسان، توصیف شده است(لامهالت و همکاران1993،199564).
1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS)
لیپوپلی ساکارید (Lps) ترکیب بزرگی از غشاء خارجی باکتریهای گرم منفی می باشد. یک بخش لیپیدی آبگریز(لیپیدA) درحدود 60% از Lps هموفیلوس آنفلوآنزا را تشکیل می دهد باقیمانده این مولکول شامل پلی ساکارید آبدوست می شود.(زمزه و همکاران 198765). لیپید A در غشای خارجی واقع است در حالی که قسمت پلی ساکاریدی بطرف خارج از سطح باکتری گسترش یافته است. برخلاف سایر باکتریهای روده ای Lps هموفیلوس آنفلوآنزا فاقد o-antigen است و بنابراین شامل یک مجموعه ساده از مونوساکاریدها می شود(فلشر و همکاران،197866).
1-6-5- نقش LPS در بیماری‌زایی
با وجود غیاب آنتی‌ژن O، LPS هموفیلوس آنفولانزا ، نقش مهمی در بیماری زایی ایفا می‌کند. نژادهای ایزوژنیک با جهش‌هایی در ژن‌های LPS منفرد و از این رو، ساختارهای LPS متفاوت ساخته شد و بقا در موش‌های صحرای نوزاد مقایسه شد(زوالن و همکاران،1986،198967). همچنین واریانت‌های LPS طبیعی، خالص شده به وسیله Mab های ویژه‌ی LPS(کیمورا و همکاران،1986،ویزر و همکاران 199868)، به مانند نژادهای جهش‌یافته‌ی ژنتیکی یا شیمیایی(کپه و همکاران،199069 ، هوود و همکاران،1996) با LPS تغییر با نژادهای والدی، برای بقا مقایسه شد. یافته‌ها تأیید کردند که LPS، به راستی در بیماری‌زایی هموفیلوس آنفولانزا دخیل است.
نقش LPS در ایجاد علائم مننژیت نیز در موش‌های صحرایی و خرگوش‌های تلقیح شده با LPS؛ به تنهایی و با ارگانیسم کاملی نشان داده شده است(ویسپلوی و همکاران،1988،سیروگیناپلووس و همکاران،198870). به دنبال تلقیح Lps افزایش در قابلیت نفوذپذیری در BBB مشاهده شد و یک ارتباط بین pleocytosis (افزایش سلول به تعداد بیش از حد طبیعی در مایع مغزی- نخاعی)، csf و قابلیت نفوذپذیری BBB به وجود آمد. نشا داده شد که سمیت LPS، عمدتا به خاطر فعالیت بخش A است، زیرا اثرات کشنده‌ی LPS، عمدتا به وسیله‌ی پیش درمان به وسیله‌ی پلی میکسین B (که به دمین لیپید A متصل می‌شود) یا از طریق دآمیله کردن LPS (که اسیدهای چرب غیرهیدروکسیله را از لیپید A حذف می‌کند) بازداری شد. از آنجایی که لیپید A در غشای خارجی ارگانیسم جای گرفته است، فعالیت اندوتوکسیک آن اغلب زمانی بروز می‌کند که این ارگانیسم، لیز شود. برای اینکه LPS بتواند سلول‌های میزبان را به طور قوی فعال کند، باید به یک پروتئین متصل شود (توبیاس و همکاران،198971). کمپلکس Lps-LBPبه CD14 غشا متصل می شود(m CD14) که به طور عمده روی سلولهای میلوئیدی وجود دارد (گویرت و همکاران،198672) و CD14 محلول (scD14) یک فرم ترشحی است که در پلاسما در حال گردش است(هازیوت و همکاران،199373 و کروگر و همکاران،199174). CD14 سپس با Toll- like receptor (TLR)(چو و همکاران 199975،یانگ و همکاران،199876، کریسچینگ و همکاران،199877) واکنش می دهد و نتیجه این واکنش به حداکثر رسیدن رهاسازی یک سیگنال سیتوپلاسمی می باشد(مدژیتو و همکاران،199778، چو و همکاران 1999) بواسطه این فعالیت کمپلکس آبشاری بواسطه تولید یک سیتوکاین چاشنی اتفاق می افتد.فعالیت سایتوکاینها و ترکیبات مکمل منجر به شوک سپتیک می شود. ترکیبات خاص از قسمت پلی ساکارید Lps نشان داده شده که در مراحل مختلف بیماری زایی مهم هستند. برای مثال بیان فسفوکولین در استقرار ارگانیسم در نازفارنکس اهمیت دارد(ویسر و همکاران،1998) در حالی که بیان یک دی گالاکتوزیدهای خاص و اسید سیالیک در طی مراحل عفونی مهم می باشد و باعث مقاومت برعلیه عوامل پاک کننده سیستم ایمنی می شود(چو و همکاران 1999،ویرجی و همکاران،1990،هوود و هککاران،1996). مکان های مختلف که سرهم شدن دومین پلی ساکاریدی Lps را فراهم می کنند بوسیله راههای ژنتیک شناسایی شده اند. نشان داده شده که چهار تا از این مکان ها شامل توالی تکراری تترانوکلئوتیدی نزدیک به انتهای می شود. تصور شده که در طی همانندسازی زنجیرهای مشابه، جفت شدن اشتباه (mis-paiy) در این نواحی تکرار شونده منجر به کاهش یا افزایش در یک یا بیشتر این تکرارها می شود. بدست آوردن تمامی نواحی ژنوم هموفیلوس آنفلوآنزا (سویه Rd) به ما اجازه شناسایی دیگر تترانوکلئوتیدهای تکراری ژن Lps همراه با، بالای بیش از 30 مورد توالی غیر تکراری که کاندید هستند به عنوان ژن Lps را می دهد. به طور مهم تر، فراوانی توالی ها، تغییرات در خاموش و روشن شدن و قابلیت تغییر مکان به ایجاد تعداد زیاید از چربی های گلیکوفرم منجر می شود و مناسب ترین فرم که در مراحل بیماری زایی تواناتر است انتخاب می شود.
1-1-6 کپسول
کپسول پلی ساکاریدی به طور قابل توجهی اهمیتش در بیماری زایی گونه های مختلف از باکتری ها مشخص شده است(رابینس و همکاران،1978). هموفیلوس آنفلوآنزا توانایی دارد که یک تا 6 کپسول (a-f) پلی ساکاریدی که از نظر شیمیایی و آنتی ژنی با هم تفاوت دارند را بیان کند. تیپ a وb پلی ساکاریدشان بدلیل اینکه قند پنج کربنه ریبیتول دارند از تیپ های c و d و e وf متفاوت است(کریسل و همکاران،197579). کپسول تیپ aشامل پلی مری از glucose-ribitol phosphate است در حالی که تیپ b شامل (PRP)poly- ribose ribitol phosphate می باشد. تیپ های cوf شامل 2-acetamido- 2-deoxyhexose می باشد که در آنها o-deacylated نیز وجود دارد.( اگان و همکاران،198080) . یپ dوe پلی ساکاریدشان شامل 2-acetamide-2-deoxy- D-mannose uronic acid می باشد.( توسی و همکاران،198181).
شکل(6-1) تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا
1-2-6- دخالت کپسول در بیماری‌زایی
یک ارتباط قوی بین تولید کپسول بوسیله هموفیلوس آنفلوآنزا و بیماری تهاجمی در انسان وجود دارد(ترک و همکاران،1967). به طور قابل توجه، گزارش شده که اگر چه هر سروتیپ می تواند به طور موفقیت آمیز در نازوفارنکس مستقر بشود، اما بیشتر از 95% از بیماری های سیستمیک در انسان توسط سویه های تیپ b ایجاد می شود( ترک و همکاران،1967،والر و همکاران،1977).
در مطالعاتی که در نوزادان موش بعد از تلقیح داخل روده ای (ip) دیده شده نیز ثابت شده که همه سویه های کپسول دار توانایی ایجاد عفونت سیستمیک را دارا می باشند اما سویه های تیپ b بیشترین ویرولانس را دارا می باشند.(سویه های بدون کپسول غیر تهاجمی هستند.) بعلاوه، بعد از تلقیح داخل وریدی(iv) فقط سویه های تیپ b باکتریمی پایدار ایجاد کردند. این تحقیقات مقدماتی بوسیله تغییر شکل دادن ساختمان کپسول همه شش سروتایپ ادامه یافت و نقش omp و Lps نیز شناسایی شد.(زوالن و همکاران،1989) بعد از تلقیح داخل بینی همه سویه ها در نازوفارنکس مستقر شدند، اما باکتریمی ایجاد شده بوسیله تیپ a وb ایجاد شد. بعد از تلقیح (ip) مشخص شد که سویه های تیپ b به طور قابل ملاحظه ای بیشتر از هر یک از سویه هایی ترنسفورم شده دیگر ویرولانس دارند.
1-3-6- ژنتیک بیان کپسول
یک کلنی منفرد هموفیلوس آنفولانزا فقط می‌تواند یک سروتیپ کپسولی سنتز کند که تنوع آنتی‌ژن نشان نمی‌دهد با این حال، کمیت کپسول تولید شده می‌تواند در بین فیلوژنی 1، که عمده تیپ های ایجادکننده‌ی عفونت تهاجمی هستند، نشان داده شده است(برافی و همکاران،1991 82،کرن و همکاران،199383). تولید کپسول به خوشه‌ای از ژن‌ها در یک لوکوس کروموزومی 18 کیلوبازی که cap نامیده می‌شود، بستگی دارد. می‌توان لوکوس cap را به سه ناحیه تقسیم کرد: ناحیه‌ی یک شامل ژن‌ها bex (bexA-D) است که ناحیه‌ی دو شامل 4 ژن دخیل در بیوسنتز پلی‌ساکارید است. ناحیه 3 شامل دو ORF است به نظر می رسد که در انتقال پلی ساکارید به سطح سلول دخیل است. گزارش شده است که در حدود 98% از نژادهای نوع b، یک حذف از بخشی ازیک کپی از bexA در یک لوکوس Cap دوگانه‌ی دیگر وجود دارد که در مجاورت مستقیم تکرارهای توالی درج IS 1016 قرار دارد(کورل و همکاران،1991،1993 84). لوکوس Cap نوع b در نژادهای رده‌ی I، عمدتاً به شکل دوگانه وجود دارد. یکی از این پلی‌ها دارای یک حذف در bex A است. در نتیجه‌ی دوگانه شدن، یک کپی از Cap به صورت نوترکیبی، از دست می‌رود و کپی دارای حذف در bexA از دست می‌رود و بیان کپسول به طور غیرقابل بازگشت، از دست می‌رود (برافی و همکاران،1991). این موتانت‌های کلاسی I، در طول رشد کشت مایع نمایی با تأخیر با فراوانی نزدیک 20% ایجاد می‌شوند. جهش‌های ثانویه که آثار کشنده‌ی ساخت PRP درون سیتوپلاسم را کاهش می‌دهند ظهور می‌کنند. حضور عنصر درج نیز تقویت Copy number لوکوس cap را تا بیش از 5 کپی که در نمونه‌های خالص شده بالینی مشاهده شده است، تسهیل می‌کند (کرن و همکاران،1993). کمیت بیان کپسول، به صورت وابسته به دوز ژن افزایش می‌یابد که ممکن است برای بیماری‌زایی سروتیپ نوع b، ضروری باشد. ارگانیسم‌هایی که کپسول بیشتری تولید می‌کنند ممکن است دارای مزیت انتخابی در مجرای تنفسی باشد. برای مثال، ممکن است کپسول هیدروفیلی یک محافظ فیزیکی در مقابل خشک شدن باشد و مقاومت در مقابل حمله‌ی غیراختصاصی نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها را افزایش دهد(روچ و همکاران،199585). ارگانیسم‌هایی که کپسول خود را از دست می‌دهند، ممکن است در تهاجم به سلول میزبان دارای مزیت انتخابی باشند(جیم و همکاران،1991،لمپ و همکاران،1982 86). چندین گروه پژوهشی، مدارکی فراهم آورده‌اند که موتانت‌های فاقد کپسول، در مورد سلول های اندوتلیال نیز نشان داده شده است. ویرجی و همکاران میانکنش‌های Hib کپسول‌دار (b+) و بدون کپسول (b-) را با HUVIECS بررسی کردند.(ویرجی و همکاران،1991) حضور کپسول نوع b، سبب کاهش تجمیع باکتری‌های با سلول‌های اندوتلیال شد. باکتری‌های –b بیشتری در مقایسه با +b وارد HUVIECS شدند.
1-1-8 روشها و آزمونهای تشخیص آزمایشگاهی:
1-2-8 روشهای تشخیص کلاسیک:
الف- نمونهها: برای تهیه گستره و کشت، نمونه از



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید