دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی
پايان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد (M.Sc.)
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما
استاد راهنما:
جناب آقای دكتر مجید گلکار
استاد مشاور:
سرکار خانم دكتر زرین تاج ولدخانی
نگـارش:
یونس آهنگر انزابی
شمار پایان نامه: 62م سال تحصیلی 93-1392
این پایان نامه را تقدیم می کنم به
پدر و مادر مهربان و بزرگوارم
که هر آنچه دارم پس از لطف خداوند یکتا از مهربانی ها و فداکاری های آن هاست که آن نیز تجلی الطاف خداست.
و نیز تقدیم می کنم به خواهر مهربان و نازنینم
به خاطرهمه همدلی هایش.
تقدیر وتشکر:
بیشترین سپاس را از استاد بزرگوار جناب آقای دکتر گل کار به واسطه حضور پر رنگ و راهنمایی های بی دریغ و دلسوزانه ایشان می دانم که بدون آن، این پایان نامه راه به جایی نمی برد.
استاد ارجمند آقای دکتر حسینی دوست را به دلیل نظرات سازنده شان سپاس می گویم.
از همکاران خوبم آقای بابایی و خانم ها امیری و محبتی که الفبای کار در آزمایشگاه را از ایشان آموختم و دوستان نازنینم آقای عظیمی و عبدالعلی پور و آقای دکتر شمس الدین و همچنین آقای سیروس ومهندس میلاد و حسام شاکری ومعصومه کولایی و آقای مهندس مهدی خرازی برای همفکری ها و همدلی هایش سپاسگزارم.
از همه مسئولین و همکاران محترم بخش انگل شناسی، دکتر نداف، خانم ها حسن، عقیقی، دکتر ولد خانی و خیر خواهان، به واسطه همکاری های صمیمانه شان و همه دوستان و عزیزانی که به طریقی در طی این طریق مرا یاری رساندند کمال تشکر را دارم.
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوریهای نوین
پايان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد (M.Sc.)
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسما
نگـارش:
یونس آهنگر انزابی
شهریور1393
هیات داوران: 1- دکتر سید رضا حسینی دوست
2- دکتر احمد رضا اسماعیلی

فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده 1
مقدمه 3
فصل اول: کلیات
1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول 12
1-2-راه انتقال 13
1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست 14
1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی 15
1-2-3-انتقال از طریق جفت 15
1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی 16
1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی 18
1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل 18
1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان 18
1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط 19
1-4-آنتي ژنهاي توكسوپلاسما گوندي 19
1-5-واکسیناسیون 21
1-6-بیماریزایی 22
1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی 24
1-8-تظاهرات بالینی 25
1-9-تشخیص توکسوپلاسموز 29
1-9-1- تشخیص مستقیم 29
1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی 29
1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی 30
1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم 30
1-9-2-تشخیص غیر مستقیم ……………………………………………………………………………………………………… 31
1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن 34
1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم 34
1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت 35
1-10-الایزا (ELISA) 35
1-10-1- الایزای مستقیم 36
1-10-2- الایزای غیر مستقیم 36
1-10-3- الایزای ساندویچ 37
1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم 37
1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم 37
1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری 37
1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ 38
1-12-تولید پروتئین نوترکیب 39
1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی 39
1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین
اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت 40
1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس 42
1-16-درمان 44
1-17-پیشگیری 47
1-18- بيان مسئله و اهميت آن 48
1-19- دلايل انتخاب موضوع 50
1-20-اهداف و فرضيا ت 51
فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته
2-1- مروری بر تحقیقات گذشته 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59
3-1-2- تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7) و
rGRA6(PUET-GRA6 60
3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده 62
3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62
3-2-2- تائيد هويت پروتئين بيان شده با روش وسترن بلات 66
3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده 71
3-4- تعيين غلظت پروتئين 71
3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) 71
3-5-1- طراحی سیستم های الایزا 72
3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا 72
3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا 74
3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن
توکسوپلاسموز با روش الایزا 76
3-6-1-برقراری شرایط الایزا 76
3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا 76
3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم 77
3-8-تعیین Cut off در روش الایزا 80
3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun 81
3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun 82
3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG 82
3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و
PUET-GRA6 83
3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN 83
3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen 85
3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index 88
3-16- کنترل کیفی 88
3-16-1- حساسیت 88
3-17-طراحی تحقیق 88
3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری 89
3-18-1- تعداد نمونه 89
3-18-2- روش نمونه گیری 89
فصل چهارم: نتایج آزمایشات
4-1 :تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6
(PUET-GRA6 92
4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات 93
4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94
4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای
ایرانی با کیت Euroimmun… 95
4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95
4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها
با کیت Euroimmun 96
4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب 100
4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار 103
4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز
عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران 103
4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت
Euroimmun با استفاده از کیت Microgen 104
فصل پنجم:بحث، پیشنهادات
منابع 121
خلاصه انگلیسی 127
ضمائم 129
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن 87
جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon 97
جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های
GRA6 وGRA7 106
جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7
بر روی سرم های زنان باردار ………………………………………………………………………………………………… 108
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی 4
شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال
نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد 7
شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم
اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش 8
شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد 9
شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط 16
شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی 25
شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا………………………………………………………………………………….. 38
شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن……………………………………………………………………. 87
شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی 92
شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی 93
شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7
تخلیص شده باروش وسترن بلات 94
شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101
شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما
در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن
عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102
شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای 105
شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن106
شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق
عفونت حاد و مزمن و تحت حاد………………………………………………………………………………………………… 107
Abbreviations:
AC- Affinity chromatography
ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity
AIDS – acquired immunodeficiency syndrome
APS – Ammonium persulfate
BAG – bradyzoite antigen
BCA – bicinchoninic acid assay
BSA – bovine serum albumin
CSF – Cerebrospinal fluid
CD – cluster of differentiation
DAB – Diamino benzidine
DNA – Deoxyiribonucleic acid
EDTA – Ethylenediaminetraacetic acid
ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay
EI – Enzyme immunoassay
FPLC – Fast protein liquid chromatography
FSH – Follicle – stimulating hormone
FDA – Food and drug Administration
GRA – granule antigen
GST – glutathione S-transferase
HCG – Human chorionic gonadotropin
HIS-TAG – histidine-tag
IEC – Ion-exchange chromatography
IMAC – immobilized – metal affinity chromatography
IPTG – Isoproyl –B-D-thio-galactoside
Ig – immunoglobulin
IFN- Interferon
IL – interleukin
LH- Luteinnizing hormone
MBP – Maltose Binding Protein
MAG – Matrix antigen
MIC – Microneme
NI-NTA – Nikel nitrilotriacetic acid
OD – Optical density
OPD – o – phenylenediaminedihydrochloride
PBS – Phosphate – bufferedsaline
PSA- Prostate – specific antigen
PV – Parasitophorus vacuole
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis
PCR – Polymerase chain reaction
RAI – Relative avidity index
ROP – Rhoptry protein
RNA – Ribonucleid acid
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SAG – surface antigen
TBS – Tris buffered Saline
TEMED – Tetramethylenediamine
TMB – Tetra Methyl Benzidine
Th – T –helper
TRX – Thioredoxin
TSH – Thriod – Stimulating hormone
TNF – Tumor necrosis factor
چکیده فارسی
توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخيص صحيح عفونت اخير (recent) توكسوپلاسما و تمايز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهميت حياتي در مراقبتهاي درماني مادر و جلوگيري از بروز عوارض عصبي- مغزي در جنين دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر مي رسد تركيب دو روش الايزاي IgM و الايزاي آويديته IgG بهترين و مطمئن ترين نتايج را براي تشخيص عفونت حاد و تمايز آن از عفونت مزمن مي دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئين GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارايي روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق براي تشخيص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراين تحقيق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست هاي استاندارد سرولوژيك براي ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئين GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمايش با پروتئين GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آويديته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آويديته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند.
کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6

مقدمه
تاریخچه و طبقه بندی
انگل توکسوپلاسما گوندی1، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو2 در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی3 در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور4 در برزیل در یك خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توكسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود كه انگل از اتوپسی چشم یك كودك مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توكسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیكی تست رنگی5 به وسیله سابین و فلدمن6 در 1948 )5(، به طور دقیق مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل7 در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاكسونومیك توكسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شكل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن8 در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است.
Kingdom: Protozoa
Phylum: Apicomplexa
Class: Sporozoea
Sub-class: Coccidia
Super- order: Eucoccidea
Order: Eucoccidida
Sub- order: Eimeriina
Family: Eimeriidae
Genus: Toxoplasma
Species: gondii
مورفولوژی و ساختار انگل
توکسوپلاسما از دو کلمه توکسون به معنای کمان یا قوس و پلاسما به معنای سلول مشتق شده است، زیرا ارگانیسم شکل هلالی یا قوسی دارد. انگل دارای سه شکل در چرخه زندگی می باشد:
1-تاکی زوایت 2-برادی زوایت 3-اسپوروزوایت
هر سه شکل انگل می توانند میزبان نهایی و واسطه را آلوده سازند )7(. ولی نقش بیولوژیک این سه شکل متفاوت است.
شکل 1-1- شكل شماتیك یك تا كی زوایت (چپ) و یك برادی زوایت (راست) توكسوپلاسما گوندی )8(
تاکی زوایت (اندودیوزوایت)
تاکی زوایت شکل آزاد انگل و مربوط به مرحله تكثیر سریع آن است که قوسی شکل، به طول 4-8 وعرض2-4 میکرومتر می باشد. در عکس های حاصل از میکروسکوپ الکترونی سیستم پیچیده ای از اندامک ها شامل غشاء نازک پوشش خارجی9، حلقه قطبی10، یک مخروط تقریباً تو خالی و بدون رأس به نام کونوئید11 در انتهای نوک تیز (قدامی)، روپتری ها12، میكرونم ها13، میتوكندری ها14، میكروتوبول های زیر غشایی15، رتیكولوم آندوپلاسمی صاف و خشن16، دستگاه گلژی17، ریبوزومها18، یك ارگانل شبیه پلاستید به نام آپیكوپلاست19 و میكروپور20 و هسته كاملاً مشخص را مشاهده کرد. )4( (شکل1-1). معمولاً هسته در جهت انتهای خلفی یا در ناحیه مركزی سلول قرار گرفته است. كروماتین به طور انبوه در تمامی هسته پخش شده و معمولاً هستک21 در مركز هسته جا دارد. کروموزوم ها طی میتوز متراکم نمی شوند، بنابراین، تعداد کروموزوم ها که 11 عدد می باشد ، اولین بار با استفاده از PFGE22 شناسایی شده است )9(. در مقاطع هیستولوژی تاکی زوایت ها اغلب تخم مرغی شکل می باشند )1(. تاکی زوایت ها به شرایط محیطی خیلی حساسند و معمولاً در خارج بدن میزبان سریعاً از بین می روند )6(. تاكی زوایت با هجوم فعالانه به غشاء سلول میزبان و یا به وسیله فاگوسیتوز وارد سلول میزبان می گردد. ابتدا انتهای كونوئید نفوذ نموده ، كونوئید به طرف جلو فرورفته و غشاء روپتری با غشاء واحد در انتهای خلفی توكسوپلاسما گوندی در آمیخته، و سوراخی را تشكیل داده كه از طریق آن ترشحات روپتری آزاد می گردد. احتمالاً محتویات روپتری ها غشای پلاسمائی سلول میزبان را در اطراف انتهای قدامی توكسو پلاسما گوندی حل می نماید. زمانی كه توكسوپلاسما گوندی وارد سلول میزبان می شود، غشای پلاسمائی پاره شده و گروهی از حفرات ریز یا وزیكول ها (احتمالاً ترشحات روپتری) در نواحی مجاور سیتوپلاسم دیده می شود. غشاء سلول میزبان تنها در انتهای قدامی توكسوپلاسما گوندی پاره می شود. در طی 15 ثانیه انگل در ماكروفاژ دیده شده، و دخول آن به وسیله فاگوسیتوز 120 ثانیه به طول می انجامد. به فاصله كوتاهی پس از نفوذ ، توكسوپلاسما گوندی به وسیله حفره یا واكوئل حامل انگل23 (PV) از سلول میزبان مجزا می شود. به نظر می رسد PV به طور دو جانبه از انگل و میزبان مشتق شده باشد )8(. تاكی زوایت به طریق غیر جنسی به وسیله آندودیوژنی24 مكرر در درون سلول میزبان تكثیرمی یابد (شكل1-3). آندودیوژنی شكل اختصاصی تقسیم بوده كه در خلال آن دو سلول دختر تشكیل شده و سلول مادری تحلیل می رود. تقسیم تاكی زوایت ها به طریق آندودیوژنی تا پر شدن سلول میزبان از انگل ها ادامه می یابد. سلول های میزبان كه حاوی تاكی زوایت های متعدد هستند، كلون ها، كلنی های نهایی یا پزودوسیست25 (کیست کاذب) نامیده می شوند. ندرتاً انگل های یك گروه به طور همزمان تقسیم شده، به طوری كه معمولاًسلول های پروژنی به طور تصادفی یا بی قاعده مرتب می شوند. با این وجود، گاهی ممكن است تقسیم همزمان پروژنی انجام شده و توده رُز مانند تشكیل گردد. گروهی از تاكی زوایت هایی كه به وسیله یك PV احاطه شده، كلون نامیده می شوند ) 8و4( . تاکی زوایت های توکسوپلاسما فاقد اندامهای حرکتی مانند تاژک ، مژه یا پای کاذب بوده و حرکت ارگانیسم با تا شدن بدن یا لغزیدن تواءم با چرخش در حول محور طولی بدن ، انقباض یا موج دار شدن انجام می گیرد(8و10). در مراحل اولیه عفونت توکسوپلاسمایی یا مرحله حاد بیماری ممکن است گروههایی از تاکی زوایت های در حال تکثیر در سیتوپلاسم سلولهای انواع بافتها مشاهده گردند که به مجموعه تاکی زوایت های داخل سلول میزبان کیست کاذب یا کلنی نهایی یا تجمعات انتهایی26 اطلاق می شود(8و10).این کلنی های تاکی زوایتی را می توان بر اساس تفاوت در رنگ پذیری از ارگانیسم های موجود در کیستهای حقیقی توکسوپلاسما متمایز نمود. شکل تاکی زوایت انگل در مرحله حاد عفونت دیده می شود و می تواند تمام سلولهای نسوج پستانداران را مورد حمله قرار دهد . پس از حمله ، انگل هر 4 تا 6 ساعت یک بار تکثیر می یابد و تجمعات شبیه به به آرایش گل تشکیل می دهد و سر انجام در هر سلول آلوده 16-8 و در مواردی تعداد بیشتری تاکی زوایت تجمع می یابد. سر انجام سلول با تعداد 64 تا 124 انگل پر شده و سپس سیتوپلاسم انباشته از تاکی زوایت سلول پاره می شود و ارگانیسم های آزاد شده به سلولهای مجاور حمله می کنند و در آنها به شیوه اندودیوژنی تکثیر می یابند(11).همچنین تاکی زوایت های آزاد شده از طریق جریان خون به بافت های متعددی از جمله سیستم اعصاب مرکزی ، چشم ،عضلات اسکلتی و قلبی راه یافته و سلولهای بافتی را آلوده می کنند. تکثیر انگل باعث ایجاد یک پاسخ التهابی شدید و تخریب بافت شده و بنابر این منجر به تظاهرات بالینی بیماری می گردد(11).
شکل 1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می
باشد )8(.
شکل 1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش .
برادی زوایت (سیستی زوایت)
ماحصل سیکل غیر جنسی انگل در میزبان است که انگل در نسوج میزبان به صورت کیستی در می آید. اندازه آن بین 120-20 میکرومتر متغیر است )1(. کیست نسجی در واقع مرحله در حال استراحت27 انگل در بدن میزبان است این کیست ها در حقیقت مجموعه ای از برادی زوایت ها ی انگلی هستند که دارای جدار کیستی نازک می باشند(برادی در زبان یونانی به معنای کند و آرام ). برادی زوایت نیز توسط تقسیم دوتایی آندودیوژنی تکثیر می شود که بر خلاف تاکی زوایت به کندی صورت می گیرد )12(. تاکی زوایت تحت تأثیر فشار پاسخ ایمنی به برادی زوایت تبدیل می شود و تشکیل کیست می دهد. کیست های بافتی حاوی صدها و هزاران برادی زوایت می باشند. برادی زوایت های داخل کیست ها مادام العمر در میزبان باقی می مانند )11(. از نظر ساختاری برادی زوایت و تاکی زوایت اندکی متفاوت هستند . در برادی زوایت ها هسته در جهت انتهای خلفی قرار دارد. برادی زوایت باریک تر از تاکی زوایت بوده و در محتوای بالای میکرونم ها و گرانول های آمیلوپکتین (منبع انرژی) با تاکی زوایت متفاوت است )8و12(. دانه های لیپیدی در برادی زوایت دیده نمی شوند ولی گاهاً در تاکی زوایت دیده می شوند. در حضور آنزیم های پروتئولیتیک، برادی زوایت ها 1-2 ساعت پایدار می مانند ولی تاکی زوایت ها در مدت 10 دقیقه از بین می روند. در گربه که میزبان نهایی است، دوره کمون عفونت زایی (فاصله بین عفونت اولیه تا دفع اووسیست ها) برای برادی زوایت کوتاهتر از تاکی زوایت است )12(. علاوه بر سرعت همانند سازی، برادی زوایت ها وتاکی زوایت ها در بیان ژن و متابولیسم نیز متفاوت هستند. بیان بعضی ژن ها اختصاصی مرحله تاکی زوایت یا برادی زوایت می باشد. همچنین متابولیسم در برادی زوایت کندتر است.
شکل 1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد)8(.
اسپوروزوایت
از نظر شكل شناسی بسیار نزدیك به تاكی زوایت می باشد. در بررسی میكروسكوپ الكترونی نیز بسیار مشابه تاكی زوایت است، جز اینكه میكرونم ها و روپتری فراوانی در اسپور زوایت وجود دارد. روپتری ها یا متراكم هستند (در برادی زوایت) یا پراكنده هستند (در تاكی زوایت). اسپوروزوایت همانند برادی زوایت، تعداد بسیار زیادی گرانول های متراكم دارد. اسپوروزوایت شكلی از انگل است كه مسئول تكثیر جنسی توكسوپلاسما گوندی در گربه (میزبان نهایی) می باشد و اووسیت ها را به وجود می آورد كه قطر 10 تا 12 میكرومتر دارند و شكل مقاوم انگل به محیط بیرونی هستند و در مدفوع گربه دفع می شوند. اسپورولاسیون یك اووسیت تولید دو اسپوروسیت می كند كه هر كدام حاوی دو اسپوروزوایت هستند )14(.
تغییر اشكال مختلف توكسوپلاسما به یكدیگر و نقش آن در بیماری زایی توكسوپلاسما
مشخصه عفونت اولیه و بیماری حاد، حضور تاكی زوایت های سریع تكثیر شونده می باشد. حدود 10 تا 14 روز بعد از عفونت، تاكی زوایت ها به برادی زوایت ها تمایز می یابند كه خیلی آهسته تر تكثیر می شوند و در سراسر بدن تشكیل كیست می دهند. كیست های بافتی مدت زیادی باقی می مانند و باعث بیماری نمی شوند. در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی مثل AIDS و بدخیمی ها، پاره شدن كیست های بافتی و تغییر شكل برادی زوایت به تاكی زوایت منجر به فعال شدن مجدد بیماری می شود. افراد مبتلا شده از طریق انتقال مادر به نوزاد نیز در معرض خطر فعال شدن مجدد بیماری هستند كه می تواند چندین بار تكرار شود و بیشتر مغز و چشم های آنها را مبتلا می كند )2(. تغییر شكل تاكی زوایت ها به برادی زوایت ها و بالعكس، نه تنها نقش حیاتی در ایجاد عفونت مزمن دارد بلكه مسئول فعال شدن مجدد بیماری نیز می باشد. فهم این فرایند می تواند همچنین در طراحی داروهای شیمیایی جدید كه قادر به از بین بردن كیست های بافتی باشند، كمك كند. همچنین شناسایی مولكول های سطحی اختصاصی هر مرحله (تاكی زوایت یا برادی زوایت) می تواند منجر به یافتن واكسن های مؤثر یا پیشنهاد راه هایی برای جلوگیری از تهاجم انگل منجر شود )8و14(.
1-1- اتصال و نفوذ توكسوپلاسما گوندی به سلول
به طور كلی، اتصال و نفوذ به سلول های میزبان توسط اشكال مختلف انگل توكسوپلاسما گوندی (تاكی زوایت، برادی زوایت و اسپور زوایت) شبیه به دیگر انگل های كوكسیدی بوده و شامل مراحل زیر است: 1- حركت كردن انگل 2- شناسایی كردن سلول میزبان با سركونوئیدال 3- دندانه دار كردن و ایجاد بریدگی در غشاء پلاسمایی سلول میزبان 4- تشكیل یك محل اتصال متحرك كه هنگامی كه انگل داخل سلول میزبان نفوذ می كند پشت سر انگل حركت می كند 5- ترشح جزئی میكرونم ها، روپتری ها و گرانول های متراكم [8]. زوایت های (اشكال مختلف توكسوپلاسما) توكسوپلاسما گوندی می توانند به سلول های مختلفی از میزبانان بسیار متفاوتی نفوذ كنند. وقتی این انگل در آزمایشگاه کشت می شود، تقریباً قادر است که تمام سلول های پستانداران، حشرات و ماهی ها را مورد تهاجم قرار دهد، كه نشان می دهد احتمالاً توکسوپلاسما قادر به بیان چندین نوع متفاوت رسپتور برای لیگاندهای مختلف می باشد یا اینکه تعداد کمی از رسپتورها که قادرند به لیگاندهای مشترک از دودمان های سلولی متفاوت متصل شوند. برای شناسایی هر یک از این دو فرضیه کارهای زیادی انجام شده و توصیف های زیادی انجام شده است و تا به امروز متوجه شده اند که گیرنده های سلول میزبان از جمله لامینین و لكتین و رسپتور سطحی توکسوپلاسما به نامSAG1 در اتصال و نفوذ توكسوپلاسما گوندی دخیل هستند [8، 10]. در واقع در اغلب موارد، غشاء دارای یک خانواده از پروتئین ها است که وابسته به آنتی ژن سطحی SAG1می باشند.SAG1 مهمترین این پروتئین ها می باشد و حداقل در قسمتی از اتفاقات اولیه در اتصال به غشاء میزبان بکار می رود. به طور واضحی این پروتئین تنها مولکول انگل که در اتصال به سلول میزبان دخیل باشد نیست به طوری که موتانت هایSag- هنوز قادر به عفونت هستند. اگر چه با مشخصات و صفات متفاوت، این موتانت ها راحت متصل نمی شوند اما به طور میانگین قادرند در مدت زمان بیشتری وارد سلول میزبان شوند. این مدت زمان ورود به داخل سلول های میزبان در این موتانت ها دو برابر تیپ های وحشی می باشد [36]. زوایت های توكسوپلاسما می توانند همچنین به وسیله راه هایی غیر از نفوذ با واسطه رسپتور، وارد سلول های میزبان شوند. اسپیر28 و همكاران دریافتند كه بعد از گذر كامل از غشاء سلولی، بعضی از زوایت های توكسوپلاسما گوندی پوششی از غشاء سلولی و سیتوپلاسم میزبان را همراه دارند ولی هنوز قادر به نفوذ به سلولهای دیگر هستند. زوایت های توكسوپلاسما همچنین می توانند توسط سلول میزبان اندوستیوز شوند و از این مسیر وارد سلول شوند [10].
اخیراً تحقیقات زیادی روی چگونگی تشكیل واكوئل پارازیتوفوروس (PV) انجام شده است. هنگامی كه تاكی زوایت ها به سلول های میزبان نفوذ می كنند به وسیله غشایی كه واضحاً از پلاسمالما (ولی عاری از پروتئین های میزبان) است احاطه می شوند. این غشاء بعداً تبدیل به غشاءPVM29)) می شود و تعدادی از پروتئین های انگل از جمله ROP2، ROP3، ROP4 و ROP7 به آن متصل می شوند ROP2 در قسمتی از PVM قرار می گیرد كه منشأ آن از سیتوپلاسم سلول میزبان است كه این احتمالاً نشانگر این است كهROP2 در ارتباطات بیوشیمیایی میزبان و انگل نقش دارد [10]. ظرف چند دقیقه بعد از نفوذ،تاكی زوایت ها PV تازه تشكیل داده، PVM را با پروتئین های انگل تغییر می دهند و یك شبكه غشایی توبولووزیكولار داخل PV شكل میدهند. PVM احتیاج به ساختارهای منفذ مانندی دارد كه به راحتی مولكول های باردار تا اندازهkDa 1200 بتوانند بین PV و سیتوپلاسم سلول میزبان حركت كنند. پروتئین های گرانول های متراكم (GRA)30 بعد از نفوذ تاكی زوایت، به داخل PV ترشح می شوند. GRA3 و GRA5 روی PVM قرار می گیرند و GRA6،GRA4 و GRA2 و GRA1 به 31TMN می پیوندند. در جمع این تغییرات یك محیط مناسب برای انگل در سیتوپلاسم سلول میزبان فراهم می كنند كه به كار تكثیر انگل می آید [10].
1-2-راه انتقال :
توکسوپلاسما گوندی یک انگل تک یاخته ای است که بیش از یک سوم جمعیت جهان به آن آلوده می باشند. عفونت عمدتا” از طریق غذا وآب الوده با اووسیست های دفع شده بوسیله گربه ها یا از طریق خوردن گوشت خام یا نیم پخته حاوی کیست های بافتی ایجاد می گردد (7و11). اما بطور کلی منبع مهم انتقال عفونت در طبیعت گربه ها و گربه سانان می باشند. گربه های آلوده اووسیست های انگل را از طریق مدفوع دفع می کنند که در خارج از بدن انسان در شرایط مناسب محیطی طی یک تا پنج روز هاگ دار و آلوده کننده می شوند و از طریق مدفوع گربه های آلوده ادامه می یابد که مدت زمان دفع اووسیست طی یک تا سه هفته و ندرتا” تکرار می شود .علی رغم اینکه تعداد گربه های دفع کننده اووسیست در هر زمان زیاد نبوده و معمولا” در اکثر کشورها بیش از 2 % نیست ، اما یک گربه آلوده ممکن است روزانه میلیونها اووسیست دفع نماید .میزان شیوع توکسوپلاسما گوندی در گربه ها به قابلیت دسترسی آنها به پرندگان و پستانداران کوچک که خود از طریق بلع اووسیست آلوده می شوند



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید