زندگی صحنه ی یکتای هنرمندی ماست
هر کسی نغمه خود خواند و از صحنه رود
صحنه پیوسته به جاست
خرم آن نغمه که مردم بسپارند به یاد

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم دارویی
دانشکده علوم و فناوری های نوین ,گروه زیست شناسی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
گرایش :میکروبیولوژی
عنوان:جداسازی و تشخیص مولکولی پاراکوویروس های انسانی از نمونه کلینیکی کودکان مبتلا به گاستروانتریت به روش تکنیک مولکولی RT_PCR
استاد راهنما:
سرکار خانم دکتر فریده قاضی
نگارش:
وحید بابایی

Islamic Azad University
Pharmaceutical Branch
Advanced Science & Technology Faculty
((M.SC)) Thesis
On Microbiology
Subject:
Isolation and Molecular Diagnosis Of Human Parechoviruses From Clinical Samples Of Children With Enterits by RT-PCR
Thesis Advisor:
Dr.Farideh Ghazi
By:
Vahid Babaei
Autumn 2014
بسمه تعالی
فرم امضاهای هیئات قضات
نام و نام خانوادگی: شماره پایان نامه: تاریخ دفاع:
این فرم به منزله تائید حضور اعضا محترم هیئت قضات در جلسه دفاع دانشجو صاحب پایان نامه است.
این پایان نامه در هیئت قضات مرکب از:
1)………………………………………………………………
2)……………………………………………………………….
3)……………………………………………………………….
4)……………………………………………………………….
5)……………………………………………………………….
6)………………………………………………………………..
مطرح و طبق صورتجلسه جداگانه با نمره………………………تصویب گردید.
اداره امور کتابخانه واحد علوم دارویی
فهرست مطالبعنوان
خلاصه فارسی1.……..…………………………………..………………………………………………………………………
مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2
(1-1 تاریخچه پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3
(2-1 تقسیم بندی پیکورنا ویورس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………. 4
(3-1 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ………………………………………………………………………………………………………………………………… 8
(4-1 ساختمان پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8
(5-1 ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………………….. 13.
(6-1 سیکل تکثیر پیکورنا ویورس ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 16.
(7-1 ترجمه ژنوم پیکورنا ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………………… 23
(8-1 پردازش پلی پروتئین در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………. 23
(1-8-1 پروتئین L …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 24
(2-8-1 پروتئین 2A ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
(3-8-1 پروتئین 3C ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24.
(9-1 تکثیر ژنوم و سنتز mRNA ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 25.
(1-9-1 RNA پلیمراز وابسته به RNA ویروسی …………………………………………………………………………………………………………. 26
(2-9-1 پروتئین 3D ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 26
(10-1 نقش پروتئین های کمکی در تکثیر ژنوم ……………………………………………………………………………………………………………. 27
(1-10-1 پروتئین 2B ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27
(2-10-1 پروتئین 2C ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 27
(3-10-1 پروتئین 3AB ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 27.
(4-10-1 پروتئین فرعی سلول ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28.
(5-10-1 پروتئین متصل کننده پرایمر برای سنتز RNA …………………………………………………………………………………………….. 28.
(11-1 محل سنتز RNA در سلول ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 29
(12-1 چگونگی تشخیص RNA ویروسی و سلولی از یکدیگر ……………………………………………………………………………………….. 31
(13-1 مرحله تجمع و تشکیل ذرات عفونی …………………………………………………………………………………………………………………….. 32
(14-1 پاراکوویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33
(1-14-1 جداسازی و خصوصیات اولیه پاراکوویروس ………………………………………………………………………………………………………. 33
(2-14-1 پروتئین های پاراکوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 34
(3-14-1 پردازش پروتئین در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………… 35
(4-14-1 توالی 5´-UTR در پاراکوویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………….. 36
(5-14-1 ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها با پیکورنا ویروس های دیگر …………………………………………………………………………… 38
(6-14-1 تداخلات بین HPeV1-2 با سطح سلولهای حساس ………………………………………………………………………………………39
(7-14-1 عوارض کلینیکی و اپیدومیولوژی پاراکوویروس ها ……………………………………………………………………………………………. 41
(8-14-1 ویروس های مرتبط با پاراکوویروس ها در حیوانات …………………………………………………………………………………………. 41
جداول:
جدول 1) اعضای خانواده پیکورنا ویریده ………………………………………………………………………………………………………………………….. 4
جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس …………………………………………………………………… 19
جدول 3) میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بینHPEV-1 وHPEV-2 …………………………………………………………..43…….
جدول 4) تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55
جدول 5) تهیه محلول های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………….57
جدول 6) توالی و موقعیت پرایمرهای طراحی شده برای ناحیه5´ UTR ……………………………………………………………………….. 59
جدول 7) نتیجه مقایسه سکانس توالی های 5UTR با بانک ژنی به روش blast…………………………………………………………………. 65
جدول 8 )نتایج blast محصول PCR ………………………………………………………………………………………. …………………………………………….73
جدول 9- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR……………….76
جدول10 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس….…………76
جدول11- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن..…….…………76
جدول 12- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل…..………….76
نمودار:
نمودار1- فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت بر اساس PCR………..…….77
نمودار-2 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب جنس………………77
نمودار-3 فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب سن……..………..78.
نمودار4 – فراوانی نمونه های مثبت پاراکوویروس های انسانی کودکان مبتلا به گاستروآنتریت برحسب فصل……..………78
اشکال:
شکل 1) نمای شماتیک کپسید ویروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 9…..
شکل 2) دیاگرام شماتیک 8 زنجیره β ………………………………………………….. ……………………………………………………. 11
شکل 3) مدلی از پولیوویروس تیپ 1 .………………………………………………………………………. ………………………… 11
شکل 4) تداخلات میریستات با پروتئین های سطح ویروس …………………………………………………………………………………………….. 13
شکل 5) تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 13
شکل 6) دو تیپ اصلی از IRES در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………………………………… 15
شکل 7) چرخه تکثیر پیکورناویروس …………………………………………………………………………………………………………………………………… 17
شکل 8) تصویر شماتیکی از Canyon …………………………………………………………………… …… …………………….20
شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP1 ……………………………………………………………………………………………… 20
شکل 10) مدل دخول پیکورنا ویروسها به درون سلول ………………………………………………………………………………………………………. 22
شکل 11) مکانیسم فرضی برای عبور RNA پیکورنا ویروس ها از عرض غشا ……………………………………………………………….. 22
شکل 12) تصویر سه بعدی از 3C pro ویروس هپاتیت A ، 2A pro رینو ویروس و FMDV Lpro …………………………… 25…..
شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتدای ژنوم پیکورنا ویروسها، محل کلیواژ vpg………………………………………………………….. 29……
شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئین …………………………………………………………………… ………………………………………………….. 30
شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوویروس ……………………………………………………………………………………………………………………… 31
شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهای ساختمانی و عملکرد 3CD pro در این مرحله ……………………………………………….. 32
شکل 17) مراحل مرفوژنز پیکورنا ویرس ها ……………………………………………………………………………………………………………………… 33
شکل 18) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروس ها …………………………………………………………………………………………………………… 36
شکل 19) دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه ………………………………………………………………………………………………………………………… 37
شکل 20) دندروگرافی براساس پروتئین VP3 در پیکورنا ویروس ها ……………………………………………………………………………… 38
شکل 21) مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوسیلی از VP1 در بین پاراکوویروس ها و CAV ………………………. 39.
شکل 22) نتایج Plaque assay پاراکوویروس انسانی تیپ 1 ……………………………………………………………………………………….. 40
شکل 23) ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروس ها و ایزوله های تازه جداشده از ویروس L jungan درحیوانات……………..42
فصل اول
کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44
بیان مساله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
(2-1 فرضیه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46 . (3-1اهداف تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47
1-4)ضرورت انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

فصل دوم
مروری بر متون گذشته………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48
فصل سوم
مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51
(1-3آماده سازي ميكروتيوب و سرسمپلرها…………………………………………………………………………………………………………………………52
(2-3 مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون ……………………………………………………………………………………………………………………………..52
(3-3 جداسازي RNA و ساخت cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………….53
(4-3سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-5) Compatent……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
3-6) ترا نسفورم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسمید)……………………………………………………………………………………………………………58
PCR (8-3……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58
(9-3 روش تهیه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
(10-3 روش آماده سازی مارکر 1kb……………………………………………………………………………………………………………………………………60
11-3)تکنیک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61
(12-3تهيه بافر الكتروفورز 1x………………………………………………………………………………………………………………………………………………61
(13-3روش استخراج DNA‌از ژل …………………………………………………………………………………………………………………………………….61
فصل چهارم
نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63
مقایسه blast برخی توالی های مثبت با توالی موجود در بانک ژنی…………………………………………………………………………………..66
فصل پنجم
بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79
بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….80
نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
توصیه ها و پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………..85
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86
خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………………….100.
اختصارات:
+ssRNA:plus sense single stranded RNA
EMCV:Encephalomyocarditis virus
FMDV:Foot and mouth disease virus
HPEV1,2:Human parechovirus type 1 and 2
cDNA:Complementary DNA
PCR:Polymerase chain reaction
HAV:Hepatitis A virus
CPE:Cytopathic effect
ICAM-1:Intercellular adhesion molecule -1
VPG:Viral protein genome linked
mRNA:Messenger RNA
IRES:Internal ribosome entry site
ORE:Open reading frame
PVR:Poliovirus receptor
RE:Restriction enzyme
RI:Replication intermediate
RF: Replication form
IPTG:Isopropyl-β-D-thiogalactoside
DAF:Decay-accelerating factor
WHO:World health organization

خلاصه:
پار اکو ویروس انسانی که به خانواده پیکورنا ویروس ها تعلق دارد, بدون غشا بوده و دارای ژنوم RNAتک رشته با قطبیت مثبت می باشد . اندازه ژنوم این ویروسKb 4/8 – 2 /7می باشد. این ویروس با بروز عفونت های گوارشی و تنفسی و گاهی عفونت های سیستم اعصاب مرکزی مرتبط است. از آنجا یی که هیچ اطلاعات درستی در مورد ژنوتایپ این ویروس در ایران وجود نداشته است این مطالعه به منظور تشخیص سریع , تعیین ژنوتایپ این ویروس در نمونه های مدفوع کودکان ایرانی زیر چهار سال مبتلا به گاستروآنتریت طراحی شده است. RNA از سوسپانسیون مدفوع استخراج شده وcDNA تهیه گردید و nested PCR با پرایمرهای اختصاصی انجام شد و محصول PCRاز ژل آگارز استخراج و تعیین توالی گردید . نتایج نشان داد که تکنیک RT-PCR برای تشخیص مستقیم HPeV در نمونه های کلینیکی کاربردی تر, حساس تر , سریعتر از روش کشت سلولی می باشد. این موضوع تایید میکند که روش RT-PCR روشی برتر برای تشخیص این ویروس درزمانی کوتاهتر و با هزینه کمتر می باشد. همچنین تشخیص سریع می تواند مانع مصرف بی رویه آنتی بیوتیک گردد.
کلمات کلیدی : پیکورناویروس- پاراکوویروس انسانی- گاستروآنتریت

مقدمه

1-1 )تاریخچه پیکورنا ویروس:
پیکورنا ویروس ها دلیل نام آنها کوچکی آنهاست که پیکو(Pico) به زبان آلمانی به معنای کوچک است یعنی ویروسهای کوچک RNA دار, و پاراکوویروس از خانواده پیکورنا ویروس ها می باشد.
پیکورنا ویروس ها، ویروس های کروی شکلی هستند که دارای ژنوم RNA ی تک زنجیره با قطبیت مثبت (+ssRNA) می باشند.اندازه این ویروس ها از kb 7.2 در (ردیف ویروس انسانی) تا Kb 7.4 در (پولیوویروس، هپاتیتA) و تا kb8.4 در (آفتو ویروس ها) متغیر است (1).
پیکورنا ویروس ها نقش شگرفی در پیشرفت ویروس شناسی مدرن داشته اند، به طوریکه FMDV1 اولین ویروس حیوانی بود که در سال 1898 توسط Frosch , Loeffler کشف گردیده. ده سال بعد در اواخر قرن بیستم، با ظهور اپیدمی پولیومیلیت شاهد ایزوله شدن عامل این عفونت (پولیوویروس) توسط popper , landsteinerk بودیم. 40سال بعد دریافتند که پولیوویروس قادر است در کشت سلولی رشد نماید. این یافته آغاز راهی برای مطالعه تکثیر ویروسها بود. سپس اندازه گیری پلاک (Plaque assay) به عنوان یک روش استاندارد در اندازه گیری عفونت زایی پولیوویروس به کار گرفته شد (3,2).
اولین RNA پلیمراز مرتبط با RNA در مننگوویروس (Mengovirus) شناسایی گردید (1) .
با انجام مطالعات بیشتر مشخص شد که ویروس ها برای ورود به سلول از یکسری گیرنده های خاص استفاده می کنند که مختص آن ویروس ها بوده و برای ورود ویروس به سلول ضروری می باشند.
پروتئین های پیکورنا ویروس ها به صورت یک پارچه سنتز شده و توسط یک یا دو پروتئین که خاصیت پروتئازی دارند بصورت آبشاری ودنبال هم می شکند و بسته به نوع ویروس12,11,10 پروتئین مجزا دارند. این پیش سازهای پروتئینی شامل2A , 3C , 3D است که نقش مهمی در همانندسازی و تکثیر ویروس دارند. به طورکلی این پروتئین ها غیر ساختمانی بوده. و فعالیتهای آنزیمی او شبه آنزیمی دارند.
بسیاری از پیکورنا ویروسها بیماریهای مختلفی در انسان ایجاد می کنند. از فلج شدید تا مننژیت اسپتیک، میوکاردیت، ضایعات وزیکولر و گزانتمی پوستی، ضایعات جلدی مخاطی، بیماری های تنفسی، بیماری های چشمی و… جدی ترین بیماری که توسط پیکورنا ویروس ها در انسان به وجود می آید پولیومیلیت است که اشکال تحت بالینی این بیماری از بیمارهای بالینی آن شایع تر می باشد (1).
1-2) تقسيم بندي پیكورناويروس ها :
این ویروس ها بر اساس خصوصیات فیزیکی، دانسیته شناوری، حساسیت به PH ، نزدیکی سرولوژیکی و اکنون بیشتر براساس خصوصیات مولکولی تقسیم بندی شده اند. براساس تجدید نظر جدید توکسونومی به 9 جنس تقیسم شده اند که البته هر جنس هم شامل زیر گروه هایی می شود (2). (جدول شماره یک)
جدول 1 )- اعضای خانواده پیکورنا ویریده.
Members of the Family PicornaviridaeSpeciesAphtovirusFoot – and – mouth disease virus
Equine rhinitis A virus
Equine rhinitis B virus
AvihepatovirusDuck hepatitis A virusCardiovirusEncephalomycarditis virus
TheilovirusEnterovirusBovine enterovirus
Human enterovirus A
(Coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus B
(Coxsackievirus,echovirus,enterovirus)
Human enterovirus C
(poliovirus,coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus D
(enterovirus)
Porcine enterovirus B
Simian enterovirus A
Human rhinovirus A
Human rhinovirus B
Human rhinovirus CErbovirusEquine rhinitis B virusHepatovirusHepatitis A virusKobuvirusAichi virus
Bovine kobuvirus
ParechovirusHuman parechovirus
Ljungan virusSepelovirusPorcine sapelovirus
Simian sapelovirus
Avian sapelovirus
SenecavirusSeneca valley virusTremovirusAvian encephalomyelitis virusTeschovirusPorcine teschovirusRefrance: Fields, B., 2013, Virology book, Vol .13
I) آفتوویروسها :
مهمترین ویروس این خانواده FMDV می باشد که حیوانات سم دار نظیر گاو، بز، گوسفند و خوک را آلوده میکند.و بندرت انسانها را نیز آلوده می نماید. هفت سروتیپ از آفتوویروسها شناسایی شده است(سروتیپAsial , SAT 1,2,3 , C , A , O ). در بین هر سروتیپ، زیرگروه های زیادی وجود دارد. این ویروس ها خیلی حساس هستند و عفونت زایی آنها در PH کمتر از 7 کاهش می یابد( 1و9و8).
II) کاردیو ویروس ها :
دارای دو شاخه مستقل است.
الف : ویروس های شبه انسفالومیوکاردیت که شامل انسفالومیوکاردیت ویروس و کلمبیا ویروس SK و مننگوویروس است. که ویروس های پاتوژن در موش هستند, البته می توانند در انسان، میمون، خوک، فیل، سنجاب هم بیماری بدهند.
ب : در این گروه ویروس هایی هستند که در سیستم عصبی تولید بیماری می کنند و شامل طیف و سیعی از ویروس ها هستند که شاخص آنها Theleris murin encephalomyelitis viruse می باشد. (5)
III) هپاتوویروسها :
ویروس هپاتیت A (HAV) که قبلاً عضوی از جنس انتر و ویروسها بود اکنون در جنس مجزایی به نام هپاتوویروس قرار گرفته است دلیل این طبقه بندی مجدد خصوصیات ویژه مولکولی HAV می باشد.
توالی نوکلئوتیدی و اسیدآمینه ای HAV با پیکورنا ویروس های دیگر تشابه کمی دارد.
تکثیر آن در کشت سلولی بدون ایجاد CPE می باشد و انتقال بیماری مدفوع- دهانی و عامل هپاتیت می شود(1و6و7و8).
IV) رینوویروس ها :
علت نامگذاری این ویروس ها به محل رشد و تکثیر آنها یعنی نازوفارنکس مربوط می شود این گروه متداول ترین عوامل سرماخوردگی در کودکان و بزرگسالان هستند. این جنس دارای اعضای بسیار زیادی است که سه تیپ و 103 سروتیپ دارد.
این ویروس به محیط اسیدی حساس بوده و در دستگاه تنفسی قدرت رشد دارند و این خاصیت آنها را از انتروویروس ها متمایز می گرداند (1و 2).
V)انتروویروسها :
این ویروسها در دستگاه گوارش تکثیر می شوند و به PH اسیدی معده مقاوم هستند. این جنس در بر گیرنده پولیوویروس2 (3 سروتیپ)، کوکساکی ویروس3(23سروتیپ)، اکوویروس4(28 سروتیپ)، انتروویروس های انسانی(4 سروتیپ) و شماری از ویروسهای غیرانسانی می باشد.
V-1/پولیوویروس ها :
قدیمی ترین ویروس شناخته شده است که شامل سه سروتیپ مجزا می باشد و سبب بیماری فلج می گردد. راه ورود ویروس مدفوعی- دهانی می باشد. ویروس بیشتر به سلول های لنفوئیدی اپی تلیال و نرون ها در سیستم عصبی مرکزی تمایل دارد. ایمنی نسبت به ویروس پولیو دائمی و جلوگیری از عفونت وابسته به واکسیناسیون است و گیرنده اختصاصی ویروس پولیو ، CD155 می باشد (1 و 2).
V-2/ اکو ویروس ها :
دلیل نامگذاری این است که ایجاد بیماری مشخص نمی کند و اولین بار از مدفوع جدا شده و بیشتر از 32 سروتیپ از آن شناخته شده است. بیماری هایی که ایجاد می کند مننژیت غیر چرکی، انسفالیت، بیماری تب دار و سرماخوردگی است و در انسان هم سبب اگلوتیناسیون اریتروسیت های گروهO می شود (1 و 4).
V-3 / کوکساکی ویروس ها :
براساس ایجاد بیماری در نوزاد موش شیرخوار به 2 گروه A , B تقسیم بندی شده اند.
گروهA : سبب بیماری فارنژیت و زیکولی، التهاب خونریزی دهنده چشم و … می شوند.
گروهB : سبب میوکاردیت، پریکاردیت، انسفالیت و پلاک های فاسد شونده در ماهیچه و مغز می شوند و راه ورود ویروس دهانی می باشد (1).
این ویروس ها از رسپتورهای مختلف مانند vitronecti receptor , I-Cam1 , CD55 جهت اتصال به سلول استفاده می کنند.(2)
VI) پاراکوویروس ها :
این جنس به تازگی طبقه بندی شده است و شامل 2 سروتیپ 5پاراکوویروس انسانی تیپ 1 و 2 است. این دو ویروس قبلاً به عنوان اکوویروس تیپ 22 و 23که جز گروه انتروویروسها طبقه بندی شده بودند. پس از مطالعه مولکولی ژنوم این ویروس ها مشخص گردید که این دو ویروس تنها 30% با پیکورناویروس های دیگر تشابه اسید آمینه ای دارند. از طرف دیگر کپسیداین ویروس ها تنها سه پروتئین دارد و کلیواژ (cleavage) پپتید VPO به VP2 و4VP صورت نمی گیرد. این موضوع منجر به طبقه بندی مجدد این ویروس ها و قرار دادن آنها در جنس جداگانه ای به نام پاراکوویروس گردید. (10)
1-3) خصوصیات فیزیکی و شیمیایی پیکورنا ویروس ها:
1-3-1)حساسیت به PHاسیدی :
انترو ویروسها ، هپاتوویروسها، کاردیوویروسها و پاراکو ویروسها به اسید معده مقاومند و عفونت زایی آنها در PHکمتر از 3 از بین نمی رود. در صورتیکه رینوویروسها و آفتوویروسها بهPH کمتر از 6 حساس اند به همین دلیل محل طبیعی تکثیر این ویروسها در بدن متفاوتند. از طرف دیگر حساس بودن رینوویروسها و آفتوویروسها به PHاسیدی در مرحلة پوشش برداری (Uncoating) نقش دارد (2).
1-3-2)دانسیته:
کاردیو و آنتروویروس دانسیته 34/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارند و FMDV دانسیته 45/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد. رینوویروس دانسیته 40/1 گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد که دلیل این اختلاف حرکت نفوذپذیری کپسیدویروس نسبت به سزیم است. کپسیدپولیو نسبت به سزیم غیر قابل نفوذ است و ویروس در چگالی شناوری سبک تری باند می شود ولی کپسیدآفتوویروسها منافذی دارد که سزیم می تواند به درون ویریون نفوذ نماید (11و 12و 13).
(3-3-1حساسیت نسبت به حلال های لیپیدی:
پیکورنا ویروس فاقد پوشش لیپیدی است و به کلروفرم، دتر جنت واتر مقاوم بوده و از بین نمی رود (6 و 14).
1-4) ساختمان پیکورناویروس:
(1-4-1کپسید:
کپسید از چهار پروتئین ساختمانی به نام vp1 ، vp2 ، vp3 ، vp4 ، تشکیل شده است. ولی در میان اعضای پاراکوویروس ها استثناء می باشند. زیرا که کپسید آن ها تنها دارای سه پروتئین VPO ، VP2 و VP4 می باشد و کلیواژهایVPO، به VP2وVP4انجام نمیشود (10).
در سال 1960 دو دانشمند به نام casper and klug مبنای ساختمانی ویروسها را تشریح کردند و نشان دادند که کپسید این ویروسها دارای ساختمان ایکوزاهدرال (Icosahedral )، تقارن بیست وجهی است که از چهار پروتئین VP4 – VP1 تشکیل شده (به استثنای پاراکوویروس) (14). یک 20 وجهی از 20 مثلث متساوی الاضلاع و 12 گوشه تشکیل یافته است (شکل 1 ). نتایج حاصل از مطالعات اشعه X و بررسی های بیوشیمیایی نشان داد که کپسید پیکورنا ویروسها واجد 60 پروتئین ساختمانی است که به صورت یک شبکه 20 وجهی استوار یافته اند. در سال 1985 ساختار اتمی پولیوویروس و رینوویروس انسانی تیپ 14 به کمک کریستالوگرافی با اشعه Xمشخص گردید (15و14).

شکل 1- نمای شماتیک کپسید ویروسها.در این شکل حالت 20 وجهی، پروتومرها و پپتیدهای شکل دهنده کپسید مشخص می باشد.شکاف کانیون (Canyon) نیز در گوشه سمت راست مشخص مي باشد.
اصلی ترین جزء سازنده در کپسید پیکورنا ویروسها را پروتومر (protomer) نامیدند. هر پروتومر از 4 پروتئین VP4–VP1 تشکیل شده است. سه پروتئین VP1، VP2 ، VP3 در سطح خارجی کپسید قرار دارند ولی VP4در سطح داخلی کپسید و در تماس با ژنوم قرار دارد. این پروتئین ها با هم شبکه ای استوانه ای را تشکیل داده که از 8 رشته زنجیره موازی و در خلاف جهت هم قرار دارند و به نام -barreljellyrollβ می نامند (16و8) (شکل 2).
این دومن یک ساختمان گوه ای شکل است که از دو روقة β موازی و در خلاف جهت هم ساخته شده اند یک ورقة β دیواره گوه را می سازد و ورقه دیگر که در مرکز قرار دارد، هم دیواره و هم کف گوه را شکل می دهد. گوه ای شکل بودن این ساختمان باعث فشرده شدن واحدهای ساختمانی شده و ایجاد یک پوستة سخت و فشرده را تسهیل می نماید. فشردگی دومن های β- barrel توسط شبکه ای از تداخلای پروتئین- پروتئین در روی کپسید داخلی بویژه در اطراف گوشه های 5 ضلعی تقویت می گردد (8و16).
پروتئین های کپسید از نظر سکانس متفاوت و از نظر توپولوژی یکسان هستند و مهمترین تفاوت پروتئین های VP1، VP2 ، VP3در لوبهای صفحات بتا(β) و در قسمتهای انتهای آمینی (N- Terminal ) و انتهای کربوکسیلی (C- Terminal) می باشد. انتهای کربوکسیلی در سطح خارجی و انتهای آمینی در سطح داخل ویروس قرار دارد (16).
دومن های β- barrelدقیقاً مشابه با ویروسهای گیاهی نظیر Southem bean mosaicوTomato bushy stunt می باشد. پروتئین های این دسته از ویروسها هیچ گونه همولوژی توالی با پیکورناویروسها ندارند. فرضیه ای که مطرح است این است که 1- پلی پپتیدها از یک جد مشترکی تکامل یافته اند. 2- دومن β- barrelیکی از محدود راههایی است که به پروتئین ها اجازه می دهد تا به فرم یک کره فشرده تجمع یابند (18 و 17).
(2-4-1 سطح خارجی ویریون:
سطح ویریون پیکورناویروس های که شیاردار است و توسط یک شکاف عمیق بنام کانیون ( Canyon ) احاطه می گردد .
(3-4-1 کانیون(Canyon):
پروتئین های VP3- VP1 شیارهای باریکی را تشکیل می دهند که کا نیون گویند. کانیون یک ناحیه بسیار فشرده و باریک است که مانع نفوذ عمقی مولکول های آنتی بادی می شود. در بعضی از پیکورنا ویروسها کانیون به عنوان محل اتصال به گیرنده عمل می کند مثل راینووپولیوویروس سطح آفتوویروس و کاردیو فاقد کا نیون است و ویریون آنها صاف تر از پیکورنا ویروس های دیگر است (20) (شکل3).
شکل 2- دیاگرام شماتیک 8 زنجیرهβ که ساختار گره ای شکل را بوجود می آورند.در اینجا لوپ هایی وجود دارد که رابطی بین ورقه های زنجیرهβ می باشد.این لوپ ها سطح ویریون را می پوشاند و به هر زیر واحد vp1-4 مورفولوژی و آنتی ژنیسیته ویژه ای می بخشند. در اکثر پیکورنا ویروس ها محل های آنتی ژنیک خنثی نوترالیزان در لوپ هایBC از VP1و VP3 یا لوپ EF درVP2 واقع شده اند.
شکل 3- مدلی از پولیوویروس تیپ 1- تاج ستاره ای شکل و ناحیه کانیون در اطراف آن مشخص است.
(4-4-1سطح داخلی ویریون:
شبکه ای که توسط انتهای آمین پروتئین های کپسیدی در سطح داخلی ویریون شکل می گیرد و نقش آن در پایداری کپسید و ویریون می باشد. در تقارن چرخشی 5 انتهای آمینی از 5´ مولکول VP3 یک ورقه بتای موازی و سیلندری شکل را بوجود می آورند. این ساختار توسط پنج ورقه بتای سه زنجیره ای احاطه شده است. ارتباط بین این دو ساختار از طریق گروه میریستات ( Myristate) متصل شده به انتهای آمینی ازVP4برقرار می گردد (4).
(5-4-1نقش پاکت هیدروفوبیک:
در کف کانیون ناحیه ای بنام پاکت ( pocket ) وجود دارد که در این منطقه لیپیدهای مختلف قرار دارند و این پاکت در پوشش برداری ویروس نقش دارد و بعضی از داروهای ضد ویروسی روی این پاکت اثر و مانع از پوشش برداری ویروس می گردند (20).
(6-4-1 نقش میرستیک اسید:
در اغلب ویروسهای خانوادة پیکورنا ویروس، اسید میریستیک توسط پیوندهای کووالانسی به اسید آمینه گلیسین در انتهای آمینی VP4 متصل می شود (18). گروههای مریستیل سبب واکنش اسیدهای آمینه موجود در پروتئین VP3 و VP4شده و این مریستیه شدن در تجمع (Assembley) و پایداری کپسید نقش دارد(19 ).
شکل 4- تداخلات میریستات با پروتئنی های سطح ویروس.
1-5) ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها:
ژنوم پیکورنا ویروسها بصورت RNA تک رشته با پلاریته مثبت ( +SSRNA) می باشد. این ژنوم عفونت زا بوده و پس از ترانسفکت نمودن سلول می تواند به پروتئین های لازم برای تکثیر ویروس ترجمه گردد. ساختار ژنوم شامل قسمتهای زیر می باشد.(شکل5)
شکل 5- تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروسها: در ابتدای 5´ ژنوم پروتئین Vpgو بعد از آن ناحیه 5´- UTR (بخش5´ غیر کد کننده) واقع شده است. در انتهای 3´ هم توالی 3´-UTR و دنبالة PolyAقرار دارد در بین این نواحی غیر قابل ترجمه بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی P1 و غیر ساختمانی P2 / P3 واقع می شود. این توالی تنها در ژنوم کاردیوویروسها و آفتوویروسها مشاهده شده است.
( Vpg ) viral protein genome linked (1-5-1 :
در ابتدای 5´ژنوم پیکورنا ویروسها، پروتئینی به نام Vpg قرار دارد (21). در ژنوم همة پیکورناها Vpg وجود دارد ولی طول آن از 22 تا 24 اسید آمینه متفاوت است. Vpgبا پیوند کووالانسی به نیمه5´یوریدیلات از RNA ی ویروسی توسط یک پیوند 5´-0-4´یوریدنیل- تیروزین متصل می شود. معمولاً تیروزینی که به RNAویروس متصل می شود، سومین اسید آمینه از انتهای آمینی Vpo می باشد در همة پیکورنا ویروسها Vpgتوسط یک ژن منفرد( 3B) کد می گردد، در حالیکه در FMDV سه ژن مسئول کد کردن Vpgهستند اگر Vpgرا از ابتدای ژنوم حذف کنیم عفونت زایی اختصاصی ویروس کاهش نمی یابد. Vpgفقط در RNAدیده می شود و در mRNAدیده نمی شود این پروتئین توسط Un linking enzyme سلول های میزبان از ژنوم برداشته می شود (23و22). تنها تفاوت بین RNAژنومی و mRNA پولیوویروس ، عدم وجود Vpgدر MRNAمی باشد. Vpgدر زنجیرة RNA حد واسط و RNA زنجیره منفی وجود دارد و عنوان می گردد که احتمالاً Vpg به عنوان پرایمر در سنتز RNAدخالت داشته باشد (24).
5´- UTR(2-5-1 :
6(5´- UTR) منطقه ای بلند و حاوی 624 تا 1199 نوکلئوتید است که بعد از Vpg قرار دارد. این ناحیه در روند تکثیر و ترجمة ژنوم مؤثر است (25).
IRES(3-5-1 :
در 5´- UTR، ناحیه ای به نام 7IRES وجود دارد که حاوی 2400- 2100 نوکلئوتید است. ریبوزوم برای ترجمه به این قسمت چسبیده و سنتز پروتئین را شروع می کند. دو تیپ اصلی از IRESوجود دارد. این عناصر در جهت دهی عمل ترجمه دخالت می کنند. در آفتوویروس ها و کاردیوویروسها قسمت 5´- UTRواجد یک ناحیة POLY (C)می باشد که تعداد بازهای آن ( 80 تا 250 نوکلئوتید در کاردیوویروسها و 100 تا 170 نوکلئوتید در آفتوویروسها ) متفاوت است. برخی از محققین طول بیشتر قطعة POLY (C)در کاردیو را مرتبط با ویرولانس بیشتر آنها در حیوانات می دانند (25).
شکل6: دو تیپ اصلی از IRESدر پیکورنا ویروسها: تصویر سمت چپ بخش 5´- UTRپولیوویروس (تیپ I نامیده می شود و در انتروویروس ها و رینوویروس ها نیز دیده می شود) و تصویرسمت راست بخش 5´- UTRانسفالومیوکاردیتیس ویروس تیپ II نام دارد و در آفتوویروسها و کاردیوویروسها مشاهده می شود) را نشان می دهد. ناحیة IRESدر داخل مستطیل مشخص می باشد. IRESهپاتو ویروسها با این دو شکل فرق دارند و برخی مقالات آنرا بعنوان تیپ سوم IRESمطرح می کنند.
(ORF) open Reading Frame(4-5-1 :
بعد از ناحیة 5´- UTR، ناحیة ORF قرار دارد که بعد از آلودگی توسط ویروس ORFبه یک پلی پروتئین بزرگ ترجمه شده و سپس توسط پروتئازهای ویروسی به 11 تا 12 پروتئین شکسته می شود و عملکرد آن جهت تهیه پروتئین های ساختمانی و غیر ساختمانی ویروس مورد استفاده قرار می گیرد.
3´- UTR(5-5-1:
در پیکورنار ویروس ها 3´- UTRکوتاه تر از 5´- UTR می باشد. این ناحیه در رینویروسها 47 نوکلئوتید و در EMCV بین 14 تا 125 نوکلئوتید طول دارد. در ناحیة 3´- UTR8یک ساختار ثانویه بنام pseudo knot وجود دارد که سنتز RNA ویروس را کنترل می نماید (26 و 27).
Poly (A) (6-5-1 :
به انتهای 3´ژنوم یک قطعه Poly (A)اتصال می یابد که طول متوسط آن از 35 نوکلئوتید درEMCVتا 100 نوکلئوتید در FMDV متغیر است و اگر دنبالة Poly (A)حذف گردد عفونت زایی ویروس از بین می رود.
در پیکورنا ویروس ها، بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی9 و غیر ساختمانی10 را به صورت p3, p2, p1مشخص می کنند. آفتو ویروس و کاردیوویروسها یک پروتئین رهبر11 (L) را قبل از قسمت P1کد می کنند. قسمت P1 ,پروتئین های ساختمانی را کد می کند ولی P2 و P3 پروتئین های غیر ساختمانی را کد می کنند. پروتئین های غیر ساختمانی در پردازش پروتئین های دیگر (2A pro,3c pro, 3cd pro )و تکثیر ( 2B, 2C, 3AB, 3B vpg, 3D pol ) مشارکت دارند (1).
1-6) سیکل تکثیر پیکورنا ویروسها:
تکثیر به طور کامل به مدت 10-6 ساعت در سیتوپلاسم سلول آلوده به ویروس صورت می گیرد.
مراحل تکثیر به صورت خلاصه و به ترتیب عبارتند از:
1-اتصال به رسپتور Attachment
2- ورود و پوشش برداری Enterance and uncoating
3- ترجمه ژنوم Translation and synthesis
4- پردازش پلی پروتئین Polyprotein processing
5- تولید ذرات جدید ویروسPyogen viruses
شکل 7- چرخة تکثیر پیکورناویروس : 1- اتصال به گیرنده 2- مرحلة پوشش برداری 3- Vpg از ابتدای ژنوم حذف و سپس RNA ترجمه می گردد 4- پلی پروتئین حاصل از ترجمه توسط پروتئازهای ویروسی به پلی پپتید مجزا کلیواژ می گردد. 5- سنتز RNA بر روی غشاء وزیکول روی می دهد. ژنوم ویروس توسط RNAپلیمراز به RNAکامل زنجیر منفی (آنتی ژنوم) تبدیل می شود. 6- از روی آنتی ژنوم تعداد زیادی RNAزنجیره مثبت ساخته می شود. 7- این زنجیره های مثبت در ابتدای سیکل عفونت به پروتئین های مورد نیاز جهت تکثیر ویروس تبدیل می شوند و در اواخر سیکل عفونی به عنوان پروژنوم جهت تولید ویروس مورد استفاده قرار می گیرند. 8و9- مراحل اسمبلی و خروج ویروسها از سلول آلوده.
1-61-)اتصال Attacment :
پیکورنا ویروسها برای عفونت زایی نیازمند اتصال به غشاء سلول میزبان می باشد تا از این طریق داخل سلول میزبان گردد. این عمل توسط یک سری مولکولهای سطحی غشاء انجام می شود، این مولکولها از سال 1989 با شناخت رسپتورهای سطحی بر علیه پولیوویروس و رینوویروس تشخیص داده شدند (28).
در زمینه رسپتورهای پیکورنا ویروس ها سه نکته مهم مشخص گردیده است:
الف) پیکورنا ویروس ها از رسپتورهای متفاوتی برای ورود به سلول استفاده می کنند.
ب) قسمتی از رسپتورها درون سلول قرار دارند مانند رسپتور کوکساکی ویروس B و A و انتروویروس .
ج) در بعضی از پیکورنا ویروس ها وجود یک رسپتور برای عفونت زایی ویروس کافی است ولی در بعضی دیگر نیاز به دو یا چند رسپتور است برای مثال، در کوکساکی ویروس A21 که رسپتور آن CD55 است برای ورود به درون سلول نیاز به 12ICAM-1 دارند (29). بعضی از کوکسا کی ویروس های گروه B علاوه بر رسپتور CD55 از α V β6 Integrinنیز به عنوان کورسپتور جهت اتصال به سلول استفاده می کنند (4). بر اساس اینکه ویروس از کجا منشاء می گیرد ویروسهای مشخص به رسپتورهای سطحی متفاوتی متصل می شوند به طور مثال FMDV – A12 به اینتگرین α Vβ3اتصال می یابد. ولی استرین O- FMDVکه به مدت طولانی در کشت سلولی رشد کرده است نمی تواند به این رسپتور متصل شود و بجایش هپاران سولفات به سطح سلول متصل می شود. استرین FMDV – A12نمی تواند سلولهای راکه فاقد β6 Integrin α هستند را آلوده کند حتی اگر هپارین سولفات در سطح سلول باشد. این موضوع نشان می دهد که ویروس خود را در آزمایشگاه سازگار نکرده است و در نبود رسپتور اصلی, خود بتدریج قادر به استفاده از رسپتورهای دیگر شده است (9).
(جدول 2) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس.
1-62-) مکانیسم اتصال به گیرنده های سطح سلولی:
کپسید پیکورنا ویروس از 4 پروتئین تشکیل شده است که این پروتئین ها بصورت یک 20 وجهی اسمبل می شوند در بین اعضای پیکورنا ویریده، پروتئین های کپسید بطور مشابه ای چیده می شوند (7و8).
در سطح کپسید پولیوویروس ها، رینو ویروس ها و کوکساکی ها یک شکاف بنام Canyon می باشد که در اطراف محور تقارن پنج وجهی قرار می گیرد. (شکل8) ولی در کاردیوویروسها، آفتوویروسها و پاراکوویروسها Canyonوجود ندارد. این محل در پولیوویروس و رینوویروس، بعنوان جایگاهی برای تداخل با گیرنده های سلول می باشد و ایجاد موتاسیون در اسیدهای آمینه این ناحیه تغییراتی در افینیتی اتصال به گیرنده ها ایجاد می کند (30و31).
شکاف پیکورنا ویروس ها باریک و عمیق است و مولکولهای آنتی بادی می توانند به درون آن نفوذ نمایند (31و30).
داروهای ضد ویروسی مانند محصولات win جای لیپید را در کف کینون گرفته و به پاکت اتصال می یابند و مانع از اتصال ویروس به گیرنده های سلولی می شوند. اتصال این دارو به رینوویروس تیپ 14 سبب تغییر شکل کنیون شده و مانع از اتصال به گیرنده های سلولی می شود. ولی اتصال دارو به رینوویروس تیپ های 1A ، 3 و 16 و پولیوویروس سبب تغییرات ساختاری کمتری می شود (32).
شکل 8- تصویر شماتیکی از Canyonنحوة متصل شدن گیرنده ، آنتی بادی به ناحیة Canyon در VP1
شکل 9- شکاف Canyonو نحوة قرار گرفتن دارو در VP1
در FMDV موتاسیون در توالی ) RGDآرژنین-گلایسین-آسپارتیک اسید)سبب ممانعت از اتصال ویروس به گیرندة سلولی می گردد ولی در کوکساکی ویروس9A توالی RGD در 17 اسید آمینه از انتهای کربوکسیی VP1واقع شده است و تغییرات در این توالی سبب عدم اتصال به گیرنده سلول نمی شود (34).
ویروس هایی مثل کوکساکی ویروس 9 Aو FMDV از طریق لوپ های سطحی خود به گیرنده های سلولی متصل می شوند. در FMDVتوالیRGDِ ( آرژنین- گلایسین- آسپارتیک اسید) در لوپ βG-βHاز پروتئین VP1کپسید قرار دارد و توسط گیرنده هایی از جنس اینتگرین شناسایی می شودو ویروس از طریق این گیرنده ها به سلول ها متصل می گردد (33و34).
1-63-)ورود به سلول و پوشش برداری ویروس:
پس از اینکه ویروس به گیرنده های سطح سلولی متصل شد باید پوشش برداری13 انجام شود و ژنوم ویروس به داخل سیتوپلاسم رها شده و در آنجا تکثیر می گردد که این عمل از طریق کاهش PH و یا فعالیت کمک گیرنده ها صورت می گیرد. به طور مثال در پولیوویروس بعد از اتصال به گیرنده PVr تغییرات اساسی در ساختار ویروس روی می دهد و پارتیکل های A بوجود می آیند و این پارتیکل ها تغییر شکل یافته و پروتئین داخلی VP4و انتهای آمینی VP1 را از دست می دهند. ذرة A هیدروفوبیک است و بعد از اتصال به ممبران سلولی کانالی را برای عبور ژنوم به درون سیتوپلاسم سلولی ایجاد و RNA ویروس وارد سیتوپلاسم سلولی می شود (36 و 35) .
نظریات متفاوتی دربارة مرحلة دخول پیکورنا ویروسها وجود دارد یک



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید