به نام خدا
معاونت پژوهش وفن آوری
منشور اخلاق پژوهش
با یاری از خداوند سبحان واعتقاد به این که عالم محضرخداست وهمواره ناظر براعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت جایگاه دانشگاه دراعتلای فرهنگ وتمدن بشری ، مادانشجویان واعضاء هیأت علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد می گردیم اصول زیر را درانجام فعالیت های پژوهشی مد نظر قرارداده وازآن تخطی نکنیم :
اصل حقیقت جویی : تلاش درراستای پی جویی حقیقت و و فاداری به آن ودوری ازهرگونه پنهان سازی حقیقت
اصل رعایت حقوق : التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان ، حیوان ونبات ) وسایرصاحبان حق .
اصل مالکیت مادی ومعنوی : تعهد به رعایت مصالح ملی ودرنظر داشتن پیشبرد وتوسعه کشور درکلیه مراحل پژوهش
اصل منافع ملی : تعهد به رعایت مصالح ملی و درنظر داشتن پیشبرد وتوسعه کشور درکلیه مراحل پژوهش
اصل رعایت انصاف وامانت : تعهد به اجتناب ازهرگونه جانبداری غیرعلمی وحفاظت ازاموال ، تجهیزات ومنابع دراختیار
اصل راز داری : تعهد به صیانت ازاسرار واطلاعات محرمانه افراد ، سازمان ها وکشوروکلیه افراد ونهادهای مرتبط با تحقیق .
اصل احترام : تعهد به رعایت حریم ها وحرمت ها درانجام تحقیقات ورعایت جانب نقد وخودداری ازهرگونه حرمت شکنی .
اصل ترویج : تعهد به رواج دانش واشاعه نتایج تحقیقات وانتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر ازمواردی که منع قانونی دارد .
اصل برائت : التزام به برائت جویی از هرگونه رفتار غیر حرفه ای واعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم وپژوهش ر ابه شائبه های غیرعلمی می آلایند .
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی
پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست‌شناسی سلولی و مولکولی گرایش میکروبیولوژی
عنوان :
جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های خاک‌زی مولد آنزیم ال-آسپارژیناز
استاد راهنما
دکتر حمیدرضا پردلی
نگارنده
راضیه عسکری
شهریور ۱۳۹3
یرفع الله الذی آمنوا مِنکم و الذینَ اوتوالعلم درجات قرآن کریم
کارشناسی ارشد آقای/ خانم راضیه عسکری با عنوان جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری های تولیدکننده ال-آسپارژیناز از خاک‌ در جلسه مورخ تحت نظارت شورای پایان‌نامه متشکل از استادان زیر با درجه و نمره مورد تأیید قرار گرفت.
1-استاد(استادان) راهنما:نام و نام خانوادگی امضاء
2- استاد(استادان)مشاور:نام و نام خانوادگی امضاء
3- داور داخل گروه: نام و نام خانوادگی امضاء
4- داور خارج از گروه: نام و نام خانوادگی امضاء
دکتر شهرام رضوان بیدختی
معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان

سپاسگزاری:
از مهربانی که ما را به نکویی و زیبایی و به خود می خواند که جنتی دارد نزدیک و زیبا و بزرگ و دوزخی دارد به گمانم کوچک و بعید و به ما می فهماند کهترس ما بیرون از دایره ی رحمت اوست و هر آنچه که به ما نداد در حکمت اوست تشکر می کنم.
در مجالی که برایم باقی است به زمانی ساده از استاد راهنمای خوبم جناب آقای دکتر حمیدرضا پردلی که به ما مهر تدریس کردند و بجای تسخیر مغزها دلهای ما را تسخیر نمودند صمیمانه سپاسگزارم.
از مادر عزیز ، دلسوز و مهربانم که آرامش روحی و آسایش فکری فراهم نمودند تا با حمایت های همه جانبه در محیطی مطلوب ، مراتب تحصیلی و نیز پایان نامه درسی را به نحو احسن به اتمام برسانم. و از براردم که همواره در طول تحصیل متحمل زحماتم بود و تکیه گاه من در مواجهه با مشکلات، و وجودش مایه دلگرمی من می باشد ،سپاسگزاری نمایم. از همکلاسی های دیروزم و هم نیمکتی های امروز م که زنگ آگاهی را در من به صدا درآوردند و پرچم دانش را در وجودم با کمک همه ی اساتید که افتخار شاگردیشان را داشتم برافراشتند ، قدردانی می کنم و آرزوی سربلندی برای ایشان دارم.
در پایان می گویم تا صبح فردا خالق عشق نگهدار همه ی شما.
فهرست مطالب
فصل اول: کلیاتچکیده فارسی1مقدمه21-1 آنزیم ال-آسپاراژیناز41-2 میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌61-3 مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز 101-4 کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز111-5 روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز 121-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز121-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز121-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز141-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز151-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز171-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی181-7-1-آنزیم‌های بومی181-7-1-1 ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی181-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا191-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG) -آسپاراژیناز) 201-8 کاربرد ال – آسپاراژینازها221-8- 1 مکانیسم عمل به‌عنوان یک کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی231-8-2 مکانیسم عمل به‌عنوان یک دارو251-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو261-10 نیمه‌عمر دارو261-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز271-11-1 عوارض ایمونولوژیک271-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز271-11-3 سمیت دارو281-12 فارموکینیتیک29فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام‌شده2_1 تحقیقات انجام‌شده در ایران و خارج از ایران322-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز 322-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی342-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از محیط کشت اختصاصی M9372-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از روش نسلریزاسیون382-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات392-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش SDS-PAGE39فصل سوم: مواد و روش‌ها 3-1 غربالگری سویه‌های مولد آنزیم از خاک423-2 جداسازی و کشت باکتری423-2-1 مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک423-2-2 کشت433-3 فعالیت آنزیم453-4 روش‌های اندازه‌گیری آمونياك453-5 مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم453-6 معرف آزمایش463-7 خواندن جذب لوله‌های Test و Blank463-8 مراحل کلونینگ473-9 شرح مراحل کلونینگ 48فصل چهارم: نتایج4-1 نتایج مربوط به جداسازی604-1-1 نتایج کشت604-1-2 نتایج رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های بیوشیمیایی614-1-3 نتایج بررسی فعالیت آنزیمی634-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته 664-1-5 نتایج مربوط به مستعد سازی 664-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس664-1-7 نتایج تست Quick- check 674-1-8 نتایج استخراج پلازمید684-1-9 نتایج PCR تاییدی694-1-10 نتایج تعیین توالی نمونهR_5 : Bacillus cereus strain694-1-11 نتایج تعیین توالی نمونه R_8 : Bacillus thuringiensis strain 744-1-12 نتایج تعیین توالی نمونه R_6 : Oerskovia turbata 79فصل 5 نتایج 5-1 نتیجه835-2 جمع بندی 835-3 محدودیت ها835-4 پیشنهادها 84منابع 85
فهرست جداول
جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز7جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن8جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز 19جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده20جدول1-5 مقایسه‌ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی و PEG29جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی 31جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت M_942جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکس PCR با در نظر گرفتن + n51جدول 3-3 شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها51جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ 0/2 cc54جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله ی Quick-check57جدول4-1 قطر هاله تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط M_9 برحسب میلی‌متر61جدول4-2 رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های آنزیم مثبت62جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن‌های بیوشیمیایی نمونه‌های آنزیم مثبت63جدول4-4 جذب نمونه های مولد آنزیم در طول‌موج 600 نانومتر64جدول4-5 جذب نمونه‌های مولد آنزیم در طول‌موج 480 نانومتر72جدول4-6 نتایج در سطح جنس و گونه80
فهرست نمودار ها
نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز11نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر64نمودار 4- 2 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر65
فهرست شکل‌ها
شکل 1-1 ساختار ال- آسپاراژیناز3شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )6شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی11شکل 1-4 هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز13شکل1-5 توپولوژی از ال-آسپاراژیناز14شکل1-6 تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم14شکل1-7 این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C15شکل1-8 باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند) 15شکل1-9 اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر16شکل1-10 ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز17شکل1-11 شکل نواری از آنزیم17شکل ‏1-12 واکنش میلارد. شاخه Z در اسیدآمینه آسپاراژین، CH2CONH2 25شکل ‏1-13نقش کاتالیزوری آنزیم آسپاراژیناز در شکستن آسپاراژین25شکل1-14 مکانیسم عمل ال-آسپاراژیناز(نارتا و همکاران 2007) 26شکل3-1 محیط MMYبراث44شکل3-2 لوله‌های آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتری46شکل4-1 تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم61شکل4-2مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها62شکل4-3 محصول PCR مورد تائید برای کلونینگ66شکل4- 4 رشد باکتری حاوی پلازمید نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار66شکل4-5 گسترش باکتری نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار جدید 67شکل4 -6 کشت باکتری نوترکیب در LB برای PEX67شکل4 – 7 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 8 R 67شکل4 – 8 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 5 R68شکل4-9 پلازمید نوترکیب استخراج شده برروی ژل 1%68شکل4-10 تکثیر قطعه هدف از روی پلازمید نوترکیب استخراجی69شکل 4-11 هم تراز سازی توالی نمونه 5 R71شکل 4-12 هم تراز سازی توالی نمونه ی 8 R77
چکیده فارسی
آنزیم آسپاراژیناز به‌طور عمده در پزشکی برای درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد1 و در صنایع غذایی برای کاهش تولید اکریل‌آمید در مواد غذایی نشاسته داری که سرخ یا برشته می‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژیناز2 جداشده از باکتری‌های مختلف دارای اثرات ضد سرطانی متفاوتی بوده است، جستجو برای یافتن میکروارگانیسم‌های تولیدکننده این آنزیم، یکی از راه‌های اصلی جهت دستیابی به آنزیمی با خصوصیات درمانی ایده آل می‌باشد. هدف این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکننده ال-آسپاراژیناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌های خاک از منابع مختلف نظیر جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهیه سوسپانسیون روی محیط کشت M_9کشت داده شدند. کلنی‌های تولیدکننده‌ی آنزیم ال-آسپاراژیناز ، بر اساس تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی متمایز گردیدند. میزان فعالیت آن بر اساس روش نسلر موردبررسی قرار گرفت. باکتری‌های‌ تولیدکننده آنزیم دارای فعالیت مطلوب، پس از شناسایی بیوشیمیایی با روش مولکولی PCR مورد شناسایی قرار گرفتند و ‌توالی rRNA S 16نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده ، بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتری های باسیلوس تورنجسیس و باسیلوس سرئوس و Oerskovia turbata می باشد. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد نمونه های خاک حاوی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز می باشد.
کلمات کلیدی: آسپاراژیناز ،لوسمی،باکتری‌های مولد، نمونه‌های خاک
فصل اول
کلیات
مقدمه
آنزیم‌ها به‌عنوان تسریع‌کننده‌های واکنش‌های شیمیایی نقش مهمی در شکل‌گیری حیات سلولی به‌نحوی‌که امروزه می‌شناسیم ایفا می‌کنند. به‌کارگیری هدفمند آنزیم‌ها به‌منظور مداخله در سیر واکنش‌های شیمیایی و بیوشیمیایی همواره یکی از موضوعات موردتوجه در صنعت و پزشکی بوده است( رائو، 1999)
باکتری‌ها از اصلی‌ترین منابع تولید آنزیم به شمار می‌رود.. در این تحقیق باکتری‌های جداشده از خاک‌های مناطق مختلف استان گلستان (مزرعه، جنگل، باغ) ازنظر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز خارج سلولی موردبررسی قرار گرفتند.
خاک یکی از مکان‌های عمده میکروارگانیسم‌ها محسوب می‌شود. فراوان‌ترین میکروارگانیسم‌ها در خاک، باکتری‌ها هستند. خاک باغچه در هر گرم محتوی میلیون‌ها باکتری است. درجاهای عمیق تعداد آن‌ها کاهش می‌یابد. قارچ‌ها به تعداد کمتر از باکتری‌ها در خاک یافت می‌شوند.( رائو، 1999)
مهم ترین گروه های باکتر ی های خاک عبارتند از :آرتروباکتر، استرپتومایسس ها ، سودوموناس، نیتروباکتریاسه،متانوموداسه،اسپیریلاسه،تیوباکتریاسه،اُ باکتریال ها ( که خود شامل گروه های ازتوباکتریاسه، ریزوبیاسه،آکروموباکتریاسه،میکروکوکاسه،کورینه باکتریاسه،باسیلاسه می باشد)، میکسوباکتریال ها، سیانوباکترها. (رائو،31999 ).
ال-آسپاراژیناز (L-asparagine amidohydrolase, EC 3.5.1.1) آنزیمی است که اسیدآمینه ال-آسپاراژین را به دو جزء آسپارتیک اسید4 و آمونیاک5 می‌شکند(رائو، 1999 )

L-asparaginas
aspartic acid + Ammonia (NH_3) O H_2 L-asparagine +
شکل 1-1 ساختار ال آسپاراژیناز( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
در حالت عادی، سلول‌های توموری قادر به تولید ال-آسپاراژین موردنیاز برای ادامه حیات سلول نیستند. بنابراین چنانچه این سلول‌ها با آنزیم ال-آسپاراژیناز تیمار گردند، به این دلیل که قادر به جایگزینی اسیدآمینه ال-آسپاراژین تخریب‌شده نمی‌باشند، به‌طور انتخابی از بین خواهند رفت بدون اینکه به سلول‌های سالم آسیب وارد گردد. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)آنزیم آسپاراژیناز در صنعت فرآوری مواد غذایی نیز برای تأمین معیار‌های مرتبط با سلامت مورداستفاده قرار می‌گیرد. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
پرسش اصلی تحقیق
1. آیا باکتری‌های استخراج‌شده آنزیم ال-آسپاراژیناز را دارا هستند؟
2.آیا پتانسیل مناسبی جهت تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز در باکتری‌های خاک‌زی وجود دارد یا خیر؟
اهداف تحقیق
1-جداسازی و شناسایی باکتری‌های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز از خاک منطقه
2-مقایسه ایزوله‌ها ازنظر میزان تولید آنزیم ال_آسپاراژیناز و معرفی سویه‌های برتر
3-شناسایی مولکولی و تعیین سکانس ایزوله‌های مؤثر در تولید آنزیم
هدف کاربردی : ایجاد دانش فنی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز
فرضیات تحقیق
1-برخی از باکتری‌های خاک‌زی پتانسیل تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز را درند.
2-احتمالاً میزان تولید آنزیم بسته به نوع خاک و محل نمونه‌گیری متفاوت است.
1- 1 آنزیم ال-آسپاراژیناز
اولین بار فعالیت آمیدوهیدرولتیک ال-آسپاراژیناز توسط لانگ6 در سال 1904 مشاهده شد و بیشتر توسط فورز و فریدمن7 در سال 1910 تأیید شد و توسط سلمانتی8 در سال 1922 فعالیت بالایی از آنزیم در سرم خوکچه‌هندی مشخص شد. فعالیت بالای ال-آسپاراژیناز فقط در سرم خوکچه‌هندی مشاهده شد درحالی‌که دیگر پستانداران فاقد این آنزیم بودند. پتانسیل آنزیم اولین بار توسط کید9در سال 1953 موردبررسی قرار گرفت که فعالیت ضدلنفوم در سرم موش مشاهده شد.پس‌ازآن نیومن10 و مک کوی11 در سال 1956 متابولیت های مختلف بدن در بین سلول‌های سالم و بدخیم در شرایط آزمایشگاهی در حضور و عدم حضور اسیدآمینه آسپارژین نشان دادند،که رشد سلولی به‌دست‌آمده از والکرسارکینوسارکوما12 نیازمند ال-آسپاراژین است هالی و همکاران13 در سال 1961 با استفاده از سلول‌های سرطانی خون نتایج مشابهی را به دست آورد .بروم14 در سال 1961 مطالعه‌ای مرتبط با فعالیت ضد لنفوم سرم خوکچه‌هندی در خصوص کاهش آسپارژین توسط ال-آسپاراژیناز انجام داد. اگرچه تئوری استفاده از آنزیم برای سرطان پذیرفته‌شده اما تعدادی مشکل در استفاده بالینی آنزیم وجود دارد که تا آن زمان خوکچه‌هندی تنها منبع بود. تنها در سال 1964ریستون15 و ماشبرن16 منابع دیگری از آنزیم و آنزیم ال-آسپاراژیناز اشیرشیا کلی17 را موردمطالعه قراردادند. دو نوع آسپاراژیناز از اشرشیا کلی تولیدشده که شامل EC-1 (سیتوپلاسمیک) و EC-2(پری پلاسمیک) است که فقط EC-2 فعالیت ضدلنفوم را از خود نشان داده است. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
ال-آسپاراژیناز در اشرشیا کلی به مقدار زیادی تولید می‌شود که منجر به آغاز طرح مطالعات بالینی ال-آسپاراژیناز شده است. اثر بالینی آنزیم توسط چندین آزمایش در بیماران تأیید شد. ریستون و یلین18 در سال 1966 موفق به خالص‌سازی بخشی از دو ایزو فرم ال-آسپاراژیناز از سرم خوکچه‌هندی شدند. جالب‌توجه است که تنها یک ایزو فرم از فعالیت ضد لنفوم در داخل بدن به نمایش گذاشته‌شده است, ازآنجایی‌که استخراج این آنزیم از سرم خوکچه‌هندی به مقدار کافی دشوار است، منابع دیگری مثل میکروب‌ها موردتوجه قرار گرفتند. اوتگن19 و همکارانش در سال 1967 برای اولین بار بود که اثرات ال-آسپاراژیناز در انسان مبتلا به لوسمی نشان دادند و در مشاهده مهم دیگر توسط اولد20و همکارانش فعالیت ضد تومور در سگ با لنفوسارکومای21 خود به خودی را نشان دادند واکنش افزایش حساسیت برای ال-آسپاراژیناز اشرشیا کلی شناخته‌شده و نسبتاً رایج است. مطالعه بر روی ال-آسپاراژیناز اشرشیا کلی و اروینیا کارتورا22 با عدم واکنش متقاطع مشخص شد، هر دو آنزیم مقدار بالایی از ایمنی‌زایی را نشان دادندکه تلاش می‌شود دارویی به‌منظور کاهش ایمنی‌زایی با حفظ فعالیت آنزیم ساخته شود. پلی اتیلن گلیکول23 (PEG) به‌عنوان یک فرآیندی که در آن واکنش‌های ایمنی لغو شده بدون اینکه خاصیت ضد سرطانی24 آن تغییر یابد به رسمیت شناخته‌شده است. این نسخه اصلاح‌شده آنزیم در مدل حیوانی کاهش تشکیل آنتی‌بادی را نشان داد و به‌طور قابل‌توجهی اثر آن طولانی‌مدت تر بود . در سال‌های اخیر استفاده از ال-آسپاراژیناز در درمان لوسمی های دیگر مانند اختلالات لنفوپرولیفراتیو25 گسترش‌یافته است.و درنهایت به‌عنوان دارو برای درمان سرطان خون توسط فاد26 در سال 1978 مورد تأیید قرار گرفت. آسپاراژیناز آنزیمی است که هیدرولیز آسپاراژین به آسپارتیک اسید را کاتالیز می‌کند. آسپاراژینازها به‌طور طبیعی توسط میکروارگانیسم‌ها تولید می‌گردند (روسی27 ،2011). دلیل استفاده از آن این است که زیست‌تخریب‌پذیر28 و غیر سمی بوده درحالی‌که بسیار پرهزینه است.(.کمبل29 ،2012)
ال-آسپاراژیناز30 فرمی از آسپاراژیناز است که بر روی اسیدآمینه ال-آسپاراژین اثر می‌کند. ال-آسپاراژین مانند سایر اسیدآمینه‌های دارای فرم ال (L)، به‌طور طبیعی طی ترجمه در سطح ریبوزوم در ساختار پروتئین‌ها قرار می‌گیرد (برخلاف اسیدآمینه‌های فرم دی (D) که طی تغییرات پس از ترجمه31 ، در ساختار پروتئین جای می‌گیرند) (پیسارویکز و همکاران،322005).
تولید ال-آسپاراژیناز از منابع میکروبی از طریق تخمیر روش امیدوارکننده‌ی است با توجه به این‌که مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محیط‌زیست است. .( اشرف ، 2003 ) ال-آسپاراژیناز در سراسر جهان به روش تخمیر در حالت مایع(SMF) تولید می‌شود اگرچه تخمیر به روش مایع هزینه‌بر است اما هنوز یک روش معمول است که در سراسر جهان برای تولید ال-آسپاراژیناز استفاده می‌شود بااین‌حال کاستی‌های اصلی تولید آنزیم به روش تخمیر مایع : غلظت کم تولید و درنتیجه کاهش حمل‌ونقل و دفع حجم مقدار زیادی از آب در طول فرآیند است. بنابراین این روش پرهزینه، بسیار مشکل و عملکرد ضعیفی دارد در این زمینه تخمیر حالت‌جامد (SSF) برای غلبه بر اشکالاتی که تخمیر مایع دارد موردتوجه فراوان قرارگرفته است. تخمیر در حالت جامد در مقایسه با روش(SMF) مؤثرتر بوده و دارای عملکردی چند برابر بالاتر است.( اشرف ، 200333)(SSF) دارای مزایای متعددی نسبت به تخمیر مایع است ازجمله نیاز به انرژی کمتر ،خطر بسیار کم آلودگی باکتریایی ، نیاز پایین‌تر به آب و نگرانی‌های زیست‌محیطی کمتر در مورد دفع زباله‌های جامد ،علاوه بر این استفاده از زباله‌های جامد کشاورزی به‌عنوان یک سوبسترا برای کربن و انرژی موردنیاز برای (SSF) باعث می‌شود که این رویکرد سازگار با محیط‌زیست شود. معمولاً بسترهایی که برای (SSF) استفاده می‌شود آب پلیمری غیرقابل‌حل از نشاسته و مواد سلولزی است.( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX) ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
1-2 میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌
میکروارگانیسم‌های مختلفی شناسایی گردیده‌اند که قادر به تولید آنزیم آسپاراژیناز می‌باشند.در جدول 1-1 نام تعدادی از این میکروارگانیسم‌ها آورده شده است. (گولاتی و همکاران 1997)
جدول ‏1-1. تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز(گولاتی و همکاران 1997)
تحقیق مربوطهمیکروارگانیسم(Dharmaraj 2011)Streptomyces noursei MTCC 1046Aljewari et al. 2010)Escherichia coli(Moorthy et al. 2010)Bacillus sp. DKMBT10Sunitha, Ellaiah, and Devi 2010))Bacillus cereus MNTG-7(Amena et al. 2010)Streptomyces gulbargensis(Basha et al. 2009)Actinomycetes sp.(Prakasham et al. 2007)Staphylococcus sp(El-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004)Pseudomonas aeruginosa(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Aspergilus tamarii(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Pencillium nigricans(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus subtilis(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus licheniformis(Gulati, Saxena, and Gupta 1997)Bacillus circulansEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Candida utilis (Aljewari, Nader,Alfaisal, Weerapreeyakul, and Barusrux 2010)Corynebacterium glutamicumEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Thermus thermophilusEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004))Erwinia cartovora(El-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004)Enterobacter aerogenesEl-Bessoumy, Sarhan, and Mansour 2004) )
Pisum sativumجدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
Properties
Production conditions
OrganismMol. wtOptimum tempOptimum pHpHTempMethod130 kDa-9/0 -يوليو—Acinetobacter calcoaceticus25 kDa , 105 kDa30-20 8/8-4/8—Acinetobacter calcoaceticus——Acinetobacter glutaminasificans(ATCC 27197)4/91 KDa376/8–SSFAspergillus niger AK-1084 KDa486/84/730SMFAzotobacter vinelandii—730-Bacillus breviskDa 84559 – 8/8—Bacillus coagulans45 KDa377-37SMFBacillus sp. 80KDa4073/730SMFCorynebacterium glutamacium5/33 KDa356/89/625SMFErwinia carotovora——Erwinia carotovora(cloned in E.coli)2/37 kDa—–Erwinia chrysanthemi 393737 kDa–2/737-Escherichia coli—2/7–Escherichia coli ATCC 1130334 kDa359745SSFFusarium equiseti34 kDa379745SSFFusarium equiseti170- 161 kDa-8—Fusarium tricincfum37 kDa ,140 kDa—–Helicobacter pylori CCUG 17874140 KDa608—Marine actinomycetes PDK2-505/7737SSF/ SMFMarine actinomycetes S337 kDa405/92/737SMFMycobacterium tuberculosis—837-Pectobacterium carotovorumMTCC 1428160 KDa3794/737SSFPseudomonas aeruginosa 50071——Pseudomonas PO7111(cloned in E.coli)25 kDa—–Pseudomonas sp Strain GG1337 kDa ,147 kDa-5/8—Serratia marcescens—-37-Serratia marcescens——Staphylococcus aureus strainNCTC413—5/739SMFStaphylococcus s. 6A85 KDa4095/840SMFStreptomyces gulbargensis13407728SMFStreptomyces sp. TA2213407728SMFStreptomyces sp. TA222±80 kDa-5/9—Thermus aquaticus strain T351146 kDa373/7—Vibrio succinogenes—4/7- 3/737-Vibrio succinogenesمیکروب‌های دریایی نشان دادند که یک منبع بالقوه برای تولید ترکیبات فعال زیستی هستند. در میان میکروارگانیسم‌های دریایی ، اکتینوباکتر به‌ عنوان قوی‌ترین منبع آنتی‌بیوتیک و سایر متابولیت های فعال زیستی موردتوجه خاصی قرارگرفته است. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012). اکتینوباکترهای دریایی یک منبع قوی از متابولیت های ثانویه بوده که اغلب این ترکیبات از استرپتومایسس مشتق شده‌اند.. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)تولید آنزیم‌های مختلف مثل: پروتئاز ، لیپاز ، کتیناز و آلژینات از استرپتومایسس دریایی گزارش‌شده است همچنین استرپتومایسس منبع خوبی از ال-آسپاراژیناز است که ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتیک اسید و آمونیاک تبدیل می‌کند که به‌عنوان عاملی برای شیمی‌درمانی استفاده می‌شود. ال-آسپاراژیناز یک عامل ضد نئوپلاستیک است که در شیمی‌درمانی لوسمی لنفوبلاستی حاد استفاده می‌شود. چندین استرپتومایسس زمینی شامل : استرپتومایسس ونزوئلا34،استرپتومایسس کارناتاکنسیس35،استرپتومایسس آلبیدوفلاووس36، استرپتومایسس لانگ اسپروس فلاووس37( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
وجود ال-آسپاراژیناز خارج سلولی در قارچ منجر به تحقیقات عمیق در توزیع این آنزیم در میان جنس‌های مختلف قارچی شده است. ال-آسپاراژیناز خارج سلولی قارچ‌ها به دلیل اینکه خیلی راحت‌تر از آنزیم‌های داخل سلولی خالص می‌شوند , سودمند هستند . ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)گزینه‌های ایده آل باید میل ترکیبی بالا ، سطح پایین ک(k)، نیمه‌عمر کافی ،ایمنی‌زایی کمتر و پایداری بالا داشته باشند. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)چندین مخمر شامل: کاندیدا ،38کریپتوکوکوس،39ساکرومیسس، 40پیچیا،41 رودوترولا، 42هانسنولا43، اسپوروبلومیسس44 T به‌عنوان تولیدکننده ال-آسپاراژیناز خارج سلولی شناخته ‌شده‌اند. آسپاراژیناز از چندین کپک شامل: فوزاریوم45،پنیسلیوم46 وآسپرژیلوس47 گزارش‌شده است( سینگ و اسریواستاوا ،2012)تولید آنزیم را می‌توان به‌وسیله تخمیر مایع(SMF) و تخمیر حالت‌جامد(SSF) انجام داد. ال-آسپاراژیناز در پردازش مواد غذایی نیز مورداستفاده قرار می‌گیرد( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
1-3 مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز
تصور بر این است که کنترل میزان تولید آنزیم آسپاراژیناز بر مبنای مدل مورفین48 که یک روش تنظیمی آلوستریک49 است انجام می‌گیرد (سلوود50و جف51، 2011 ).مورفین، پروتئینی است که می‌تواند دو و یا تعداد بیشتری هومو-اولیگومر52 (فرم‌های مورفینی) ایجاد کند، اما برای تبدیل‌شدن به این فرم‌ها، لازم است که اجزایش از هم جداشده و تغییر شکل دهد (شکل ‏1-3) (جف، 2005).
شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی.( سلوود و جف ، 2011).
1-4 کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز:
بر اساس داده‌های بیوشیمیایی و کریستالو گرافی53 ال-آسپاراژیناز را می‌توان به 3 خانواده تقسیم کرد :
1-خانواده اول مربوط به آسپاراژیناز نوع باکتریایی
2-خانواده دوم مربوط به آسپاراژیناز نوع گیاهی
3-خانواده سوم آنزیم‌های مشابه آسپاراژیناز Rhizobium etii
آنزیم‌های موجود در این طبقه‌بندی تعدادی از واکنش‌های مختلف آنزیمی ازجمله واکنش‌های مرتبط با سنتز پروتئین را کاتالیز می‌کنند.( ظافرالمجیدی،2011)
نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز(بورک54 و جاسکولسکی،55 2001)
1-5 روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز
روش‌های کمی برای استفاده در تجسم ترتیب قرار گرفتن اتم در مولکول‌ها وجود دارد. در حال حاضر تنها دو روش که می‌تواند تفکیک‌پذیری اتمی برای پروتئین را روشن کند که اشعه ایکس56 و تجزیه‌وتحلیل رزونانس مغناطیسی هسته57 است. (بورک و جاسکولسکی ، 2001)
1-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز
1-6-1ساختار مونومری آنریم ال-آسپاراژیناز
شکل 1-3 توالی اسیدآمینه برای ErCAR را نشان می‌دهد. هر مونومر 330 اسیدآمینه است .نمایش 14 رشته β و 13 رشته α هلیکس است. (آندرسون ،2006)
دومین N-ترمینال58 بزرگ‌تر ، از 8 رشته آنتی پارالل59 مخلوط صفحه β و دومین C-ترمینال کوچک‌تر از صفحات β پارالل تشکیل‌شده است.شکل1-4 (آندرسون ،2006)
شکل 1-4 : هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز از ErCAR , ErCHR(PDB-code: 1HG1) و ECOLI(PDB-CODE:4ECA) . ساختار دوم برای ErCAR به رنگ آبی و جایگاه فعال باقی‌مانده با پیکان سیاه مشخص‌شده است(آندرسون ،2006)
در برخی از باقی‌مانده‌ها ارتباط حلقه‌ای (لوپ) که نمی‌تواند مدل‌سازی شود وجود دارد. این باقی‌مانده شامل 29-25 در زنجیره A، 23-33 در زنجیره B ،23-31 در زنجیره C ، 27-30 در زنجیره D ،33-23در زنجیره E ، 25-32در زنجیره F ، 19-32در زنجیره G، 21-30 در زنجیره H بود. برخی از اختلالات به نظر می‌رسد که با توجه به عدم تعادل، بخصوص برای باقیمانده واقع در نزدیکی سطح است. برای مثال زیر واحد مونومر در شکل 1-5 را ببینید. (آندرسون ،2006)
شکل1-5 : توپولوژی از ال-آسپاراژیناز ErCRA. پیکان‌ها نشان‌دهنده صفحات بتا و مستطیل‌ها آلفا- هلیکس و هلیکس های تیره‌رنگ در سمت مخالف صفحات قرار گرفتند . کادر نشان‌دهنده دومین N است. (آندرسون ،2006)
شکل1-6 : تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم. دومین Nو C در شکل مشخص‌شده است. (آندرسون ،2006)
1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز
مطابق با نتایج گزارش‌شده قبلی ، جایگاه فعال آنزیم بین دومین N و C ترمینال از هر دو مونومر مجاور قرار دارد. اثر متقابل بین دو زیر واحد ، جایگاه فعال را تشکیل می‌دهد و دایمرهای A-C ، B-D ، E-G ، F-H ایجاد می‌کنند. جایگاه غیرفعال در هر یک از بخش‌های دایمر یافت شده است(شکل1-9). باقی‌مانده‌هایی که در هر مونومر در سایت فعال درگیر هستند Thr15 , Ser62 , Thr96 , Asp13 (شکل 1-10) و باقی‌مانده کاتالیتیک Thr15 و95 Thrهستند. (آندرسون ،2006)
شکل1-7 : این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C و لیگاندهای نشان‌دار با شکل گلوله‌های قرمز را نشان می‌دهد. (آندرسون ،2006)
4 جایگاه فعال برای همکاری با یکدیگر وجود ندارد . تقاطع بین رشته‌های چهارم و پنجم در دومین N-ترمینال چپ دست است و چیزی که معمولاً در ارتباط زیاد با فعالیت دیده می‌شود. (آندرسون ،2006)
شکل1-8: باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند) (آندرسون ،2006)
1-6-2 ساختار تترامرآنزیم ال-آسپاراژیناز
دو تترامر در واحد نامتقارن وجود دارد. مونومرهای طراحی‌شده A-H است که ABCD یک تترامر را تشکیل می‌دهد و EFGH باعث ایجاد دومین تترامر می‌شود. این دو تترامراز هر جنبه‌ای بسیار شبیه به یکدیگر هستند. (آندرسون ،2006) هر زیر واحد از تترامر باعث ایجاد دو نوع تماس با زیر واحدهای مجاور می‌شود. تماس‌های نزدیک باعث تشکیل دایمر و تماس‌های دور تشکیل تترامر را می‌دهد. تجمع دو دایمر A-B و C-D به ترتیب E-F ، G-H شکل کروی تترامر را تشکیل می‌دهد(شکل1-7 و شکل 1-9 ) (آندرسون ،2006)
(a) Subunit A and C (b) Subunit B and D
شکل1-9 : اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر نشان داده‌شده است(آندرسون ،2006)
توالی اسیدآمینه چند آنزیم ال-آسپاراژیناز مختلف گزارش‌شده است ازجمله آنزیم اشرشیا کلی. مطالعات کریستالوگرافی اشعهX ، جهش T89V ، ال-آسپاراژیناز اشیرشیا کلی ، ولینلا ساکینوژنز و گلوتامیناز-آسپاراژیناز سودوموناس VA نشان داد که این پروتئین به‌صورت یک تترامر با 4 زیر واحد یکسان و وزن مولکولی 35000 است(آندرسون ،2006)
مطالعات درزمینه اشعهX برای آنزیم ال-آسپاراژیناز اشرشیا کلی نشان داد که این پروتئین از 4 زیر واحد یکسان تشکیل‌شده است و این تترامر می تواند به‌عنوان یک دایمر60 از دایمر intimate در نظر گرفته شود. هر دایمر دارای 2 مرکز فعال است که هرکدام از آن‌ها با زنجیره‌ای از اسیدآمینه در هر دو زیر واحد تشکیل‌شده‌اند. (استکر و همکاران،1999) اگرچه دایمر دارای تمام عناصر ساختاری و گروه عاملی برای ایجاد یک جایگاه فعال است اما آنزیم همیشه به‌صورت تترامر فعال است.تشکیل تترامر باعث کاهش مقدار قابل‌توجهی از انرژی آزاد آنزیم می‌شود درحالی‌که نیروهای یونی و پیوند هیدروژنی عامل اصلی برای ایجاد ساختار دوم و سوم آنزیم است.نیروهای بین زیر واحد در تترامر عمدتاً آب‌گریز هستند(استکر و همکاران،1999)

شکل1-10 ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز نقاشی شده با Molscript مونومر های رنگی محصولات واکنش آسپارتات بوده که به جایگاه فعال آنزیم متصل هستند که به‌عنوان مدل چوپ و توپ نشان داده‌شده است.(.استکر و همکاران1999)
1-6-3 ساختار اُکتامرآنزیم ال-آسپاراژیناز
تشکیل سایت فعال نشان‌دهنده تعامل دایمر برای فعالیت‌های آسپاراژیناز به شکل تترامر و بیشتر به شکل اُکتامر در شکل 1-8 نشان داده‌شده است. هر تترامر دارای تقارن 222 و اکتامر با تقارن 2 برابر بین تترامرها مشخص‌شده است. اثر متقابل مشاهده‌شده برای مثال c148 Arg برای F215Asp یک پل نمکی بین دو تترامر ایجاد کردند. این نوع تماس‌ها اِلکترواستاتیک و در درجاتی هم پیوند هیدروژنی است (آندرسون ،2006)
شکل1-11: شکل نواری از آنزیم 2تترامر را نشان می‌دهد که هر رنگ نشان‌دهنده یک مونومر است. (آندرسون ،2006)
1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی:
امروزه ال-آسپاراژیناز استفاده‌شده در کلینیک به‌صورت 3 فرآورده موجود است : 2 نوع اصلاح‌نشده یا بومی ( خالص‌شده از منابع باکتریایی )و 1 نوع اصلاح‌شده از یکی از فرآورده‌های بومی است. محصول باکتری اروینیا به‌صورت تجاری در کانادا و اروپا به‌عنوان اروینیاز توسط پروتون61 به بازار عرضه‌شده است( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
1-7-1-آنزیم‌های بومی:
ایزو آنزیم‌های مختلفی از ال-آسپاراژیناز با استفاده از گونه‌های مختلف اشرشیا کلی جداشده است. ال-آسپاراژیناز خالص‌شده اشرشیا کلی دارای وزن مولکولی 133-141 کیلو دالتون است. همه ال-آسپاراژینازها متشکل از 4 زیر واحد و 1 جایگاه فعال در هر واحد هستند که وزن مولکولی که برای هر یک از زیر واحدها گزارش‌شده 22 کیلو دالتون است. کورهولز62و همکارانش نشان دادند که وزن مولکولی هر یک از زیر واحدها برای ال-آسپاراژیناز اشرشیا کلی حدود 32 کیلو دالتون است و برای اروینیا 40 کیلو دالتون است. ( سینگ و اسریواستاوا ،2012)وزن مولکولی ال-آسپاراژیناز باکتری اروینیا 138 کیلو دالتون یافت شده است و فعالیت اختصاصی آنزیم خالص‌شده بین 300 و 400 میلی مول از سوبسترا در هر دقیقه برای هر میلی‌گرم از پروتئین گزارش شد.نقطه ایزو الکتریک آنزیم اشرشیا کلی بین رنج 4 pH= و 5 =pH و برای اروینیا در حدود 8 pH= است. مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز در جدول1-2 آورده شده است که این ال-آسپاراژینازهای شناخته‌شده دارای بیش از 10% فعالیت گلوتامیناز هستند. ال-آسپاراژیناز خوکچه‌هندی هیچ فعالیت گلوتامینازی نداشت اما هرگز به‌اندازه کافی برای آزمایش‌های بالینی در دسترس نبود( سینگ و اسریواستاوا ،2012)
1-7-1-1 ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی
ال-آسپاراژیناز مشتق شده از اشرشیا کلی از سال 1960 در درمان لوسمی حاد استفاده می‌شد و به شکل بیشتر آسپاراژیناز موردمطالعه قرار گرفت. این دارو ممکن است به‌عنوان انفوزیون داخل وریدی یا به‌عنوان تزریق داخل عضلانی تجویز شود. مطالعات اولیه از ال-آسپاراژیناز در بیماری ALL زمانی که آنزیم به مدت 28 روز متوالی داده شد موردمطالعه قرار گرفت. (نارتا و همکاران، 2007)نیمه‌عمر فعالیت آنزیم در کودکان حدود 24/1 روز است. در افراد بزرگ‌سال مبتلابه لوسمی دارو به‌صورت داخل وریدی یا عضلانی تجویزشده است و معمولاً با دوز u/m2 25000در یک روز و یا در رژیمی با u/m2 6000یک روز در میان برای 6 تا 9 روز داده‌شده است. کاهش آسپاراژین سرم در اکثر کودکان تحت درمان در یک برنامه زبان بندی شده با گرفتن u/m2 2500-5000 از روز سوم تا روز هشتم تکمیل‌شده است. ال-آسپاراژیناز از سد خونی مغزی عبور نمی‌کند اما این دارو توانسته با موفقیت ال-آسپاراژین در مایع نخاعی را کاهش دهد. (نارتا و همکاران، 2007)
1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا :
ال-آسپاراژیناز در حال حاضر با استفاده از اروینیا کریزانتمی تولید می‌شود. ال-آسپاراژیناز اروینیا می‌توان به‌صورت داخل وریدی و یا داخل عضلانی تجویز گردد.باکتری اروینیا در حال حاضر برای درمان سرطان خون در انگلستان تائید شده است. (نارتا و همکاران، 2007)باکتری اروینیا دارای یک نیمه‌عمر کوتاه در مقایسه با ال-آسپاراژیناز است و این دارو باید در دوزهای بالاتر داده می‌شود و در اغلب موارد ال-آسپاراژیناز در جهت تخلیه آسپاراژین به‌طور کامل داده‌شده است. سطح آسپاراژین در بیماران دریافت‌کننده اروینیا دست‌کم در کودکان به‌سرعت بهبود می‌یابد. (نارتا و همکاران، 2007)باکتری اروینیا ثابت کرده که در بیمارانی با واکنش‌های آلرژیک شدید به ال-آسپاراژیناز مؤثر است. کاربرد دیگری از اروینیا احتمالاً در بیمارانی با تشکیل آنتی‌بادی با فرآورده‌های آسپاراژیناز اشرشیا کلی است. آسپاراژیناز اروینیا می‌تواند سریعاً آسپاراژین را به دام بیندازد و برای کاهش آسپاراژین بهتر است. (نارتا و همکاران، 2007)
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز (نارتا و همکاران، 2007)
فعالیت گلوتامینازوزن مخصوصمیکروارگانیسم2%270u/gE.coli10%700 u/g Erwinia5%60u/g Serratia0u/g 50Gainea pig serum
خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا به‌طور گسترده بررسی‌شده است .و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده به‌طور خلاصه در جدول1- 4 آورده شده است. (نارتا و همکاران، 2007)
جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده (نارتا و همکاران، 2007)
اروینیاE.coli
PEG
بومی700-650400-280400-280Activity (IU/mg protein)121212Km L-asparaginas14530003000Km L-glutaminas1/003/003/0l-Glu/l-Asp (maximal activity)138000-141000Molecular weight8.755PI
1-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG) -آسپاراژیناز)
PEGlation از اشرشیا کلی به‌دست‌آمده و زمان گردش آنزیم آسپاراژیناز را افزایش می‌دهد و باعث کاهش ایمنی‌زایی توسط آسپاراژیناز می‌شود. PEG-آسپاراژیناز فارماکوکینیتیک است در غیر این صورت مشابه آسپاراژیناز طبیعی است. (نارتا و همکاران، 2007)این آنزیم یک انتشار تک سمتی ، نیمه‌عمر منوفازیک و یک مرحله حذفی رانشان می‌دهد. نیمه‌عمر طولانی‌مدت از مهم‌ترین ویژگی‌های این دارو است. PEG-آسپاراژیناز دارای یک نیمه‌عمر حدود 6 روز است و به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای از فرآورده‌های اروینیا و اشرشیا کلی طولانی تر است. تزریق یک نوبت از PEG-آسپاراژیناز می‌تواند بجای یک سری از تزریق‌های آسپاراژیناز جایگزین شود.آنتی‌بادی تشکیل‌شده علیه PEG-آسپاراژیناز می‌تواند پاک‌سازی دارو را تغییر دهد. علاوه بر حساسیت آشکار ، نیمه‌عمر در صورت تشکیل آنتی‌بادی نهفته کوتاه باشد. (نارتا و همکاران، 2007)
ایمنی‌زایی بالا، در حدود 25% از بیماران به‌صورت ابتلا به پروتئین خارجی , آلرژی خفیف و واکنش شوک آنافیلاکتیک دیده‌شده است. تلاش‌هایی برای کاهش ایمنی‌زایی درحالی‌که آنزیم فعالیت خود را حفظ کند و نیمه‌عمر طولانی‌تر داشته باشد انجام‌شده است. در اواسط سال 1970 چندین گروه با استفاده از روش‌های مختلف ال-آسپاراژیناز را به‌صورت شیمیایی اصلاح کردند تا ایمنی‌زایی کمتر و فعالیت ضد توموری خوبی داشته باشد. PEGlation , که از لقاح ال-آسپاراژیناز به PEG تهیه‌شده از موفق‌ترین روش‌های تغییرات شیمیایی است که در سال 1970 و 1980 توسعه داده‌شده است. آبوچووسکی63 و همکارانش برای اولین بار موفق به لقاح PEG با ال-آسپاراژیناز شدند. لقاح آنزیم با PEG موفق به لغو ایمنی‌زایی دارو شده است. خواص بیوشیمیایی از PEG ال-آسپاراژیناز تجاری به‌عنوان Pegasparase شناخته‌شده است که به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای از تفاوت آنزیم‌های بومی است که وزن ظاهری آن‌ها بیشتر است و واکنش آن‌ها با آنتی‌بادی خالص خیلی کم است اما اگر دارو در معرض انجماد ذوب شود افزایش می‌یابد. مطالعات بالینی نشان داد که آنزیم دارای فعالیت ضد توموری در هر دو مدل حیوانی و انسانی بود. (نارتا و همکاران، 2007)ایمنی‌زایی در بدن کاهش می‌یابد که به‌شدت در کودکان حساس به چندین بیماری ALL تأییدشده است. اتینگر64و همکارانش در سال 1994 عدم شوک آنافیلاکسی , کاهش قند خون , پانکراتیت در درمان با PEG با ال-آسپاراژیناز گزارش کردند. فرآورده‌های تجاری در دسترس برای درمان با نام عمومی پگاسپاراز و ONCASPAR که علامت تجاری از تولیدکننده ENZON , South plainfield وجود دارند. در لقاح ال-آسپاراژیناز با دکستران سعی شده که ثبات پروتئولیتیکی ، حرارتی و کاهش ایمونولوژی بهبود یابد. آرن و روجین65 در سال 1979 از پلی دی آلانین پپتیداز66 برای جلوگیری از اپی توپ ایمنی‌زایی باکتری اشرشیا کلی و اروینیا استفاده کردند اما مطالعات بالینی تا به امروز انجام‌نشده است (نارتا و همکاران، 2007) Acylationبه‌عنوان یک روش برای اصلاح ال-آسپاراژیناز است اما محدودیت این روش آن است که آنزیم پس از اصلاح آب‌گریز می‌شود. آنزیم محبوس شده در گلبول قرمز خون کاملاً پایدار بوده و به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای در داخل بدن نیمه‌عمر طولانی دارد. (نارتا و همکاران، 2007)انفوزیون وریدی67 در محیط منجر به حذف آنزیم برای مدت 2 هفته شده اما ایمنی‌زایی از آنزیم تنها اندکی کاهش‌یافته است (نارتا و همکاران، 2007)پالمیتل68 ال- آسپارژیناز یکی دیگر از مشتقات آنزیم تغییریافته شیمیایی است که در لیزوزوم محصورشده که در مدل حیوانی موردمطالعه قرارگرفته است که نیمه‌عمری 10 برابر طولانی‌تر بدون سمیت حاد به نمایش گذاشته است. (نارتا و همکاران، 2007)از بین بردن ایمنی‌زایی در آنزیم به‌وسیله جهش در جایگاه فعال آنزیم در باکتری اروینیا کریزانتمی69 با استفاده از سنتز هگزاپپتید و آنتی سرم پلی کلونال در خرگوش , موش موردمطالعه قرار گرفت.هری70و همکارانش در سال 1986 کلونیزاسیون و بیان آنزیم آسپاراژیناز اروینیا کریزانتمی در E.coli و اروینیا کارتورا71 را نشان داد که بیان 3 برابر بالاتر بود. (نارتا و همکاران، 2007)
1-8 کاربرد ال – آسپاراژینازها
انواع مختلفی از ال – آسپاراژینازها می‌توانند برای مقاصد مختلف صنعتی و پزشکی مورداستفاده قرار گیرند. رایج‌ترین کاربرد آسپاراژینازها، استفاده از آن‌ها به‌عنوان کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی می‌باشد. (براست، 2010 )آسپاراژیناز‌هایی تحت نام‌های تجاری Acrylaway و PreventASe نمونه‌هایی از این آنزیم هستند که در فرآیند فرآوری محصولات غذایی مورداستفاده قرارگرفته و میزان تولید اکریل‌آماید72 که به‌عنوان یک ماده سرطان‌زا شناخته می‌شود- را در مواد غذایی دارای نشاسته ازجمله اسنک و بیسکویت، کاهش می‌دهند (براست، 201073).در درمان بیماری هوچکین ، درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد به‌طور عمده در کودکان ،لوسمی حاد میلوسیستیک ، لوسمی میلومونوسیستیک ، لوسمی لنفوسیتی مزمن ، درمان لنفوسارکوما ، رتیکلوسارکوما و ملانوسارکوما استفاده می‌شود. آنزیم ال-آسپاراژیناز یک عامل مهم در شیمی‌درمانی است که برای درمان انواع لنفوپرولیفراتیویسوردرس و لوسمی لنفوبلاستی حاد به‌خصوص (ALL) استفاد(براست، 2010 )ه می‌شود. از این آنزیم به‌عنوان یک عامل اصلی در پروتکل شیمی‌درمانی برای درمان کودکان مبتلا به (ALL) برای تقریباً 30 سال که استفاده می‌شود. ال-آسپاراژیناز به‌عنوان یک دارو اثربخشی در القاء و بهبود استراتژی مراحل مختلف شیمی‌درمانی را نشان داد.محدودیت عمده استفاده از این آنزیم آن است که حساسیت بالینی در 78-3% از بیماران درمان شده با فرم اصلاح‌نشده آنزیم پیشرفت کرده است. در طول 10 سال گذشته PEG ال-آسپاراژیناز به‌عنوان یک جایگزین برای ال-آسپاراژیناز شناخته‌شده است. (نارتا و همکاران،2006)
آسپاراژیناز دیگری تحت نام تجاری اِلسپار74 به‌عنوان دارویی



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید