منشور اخلاق پژوهش
با یاری خداوند سبحان و اعتقاد به این که عالم محضر خداست و همواره ناظر بر اعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت جایگاه دانشگاه در اعتلای فرهنگ و تمدن بشری، ما دانشجویان و اعضاء هیات علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد می گردیم اصول زیر را ر انجام فعالیت های پژوهشی مد نظر قرار داده و از آن تخطی نکنیم:
1- اصل برائت: التزام به برائت جویی از هر گونه رفتار غیر حرفه ای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبه های غیر علمی می آلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هر گونه جانب داری غیر علمی و حفاظت از اموال، تجهیزات و منابع در اختیار.
3- اصل ترویج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعایت حریم ها و حرمت ها درانجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری از هر گونه حرمت شکنی.
5- اصل رعایت حقوق: التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان ( انسان، حیوان و نبات) و سایر صاحبان حق.
6- اصل راز داری: تعهد به صیانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان ها و کشور و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی: تلاش در راستای پی جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هر گونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی و معنوی: تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی: تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظر داشتن پیشبرد و ت.سعه کشور در کلیه مراحل پژوهش.
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده علوم پایه، گروه میکروبیولوژی
پایان نامه :
جهت دریافت درجه کارشناسی ارشدزیست شناسی
گرایش میکروبیولوژی( M.Sc)
عنوان:
جداسازي، تعیین هویت مولکولی وتهیه الگوی ژنومی مایکوباکتریوم های کمپلکس توبرکلوزیس ازگاوهای توبرکولین مثبت استان خراسان
استاد راهنما:
دکتر نادر مصوری
استاد مشاور:
دکتر کیوان تدین
نگارش:
محبوبه احمدی
من لم یشکر المخلوق، لم یشکر الخالق
حمد و سپاس یکتای بی همتا را که لطفش بر ما عیان است، ادای شکرش را هیچ زبان و دریای فضلش را هیچ کران نیست و اگر در این وادی هستیم، همه محبت اوست.
الهی ای مهربانتر از ما به ما، از تو می خواهم همه کسانی را که حتی ذره ای در انجام این امر مرا یاری نموده اند، در سایه لطف بی کرانت، سلامت، شادکام و موفق بداری.
با تشکر و سپاس فراوان از استاد عالی قدر جناب آقای دکتر حسین محمدپورکارگر که مشوق اصلی من برای ادامه تحصیل بوده اند.
و با تشکر و قدردانی از زحمات بی دریغ استاد راهنما جناب آقای دکتر نادر مصوری و راهنمایی های ارزنده استاد مشاور جناب آقای دکتر کیوان تدین.
از جناب آقای دکتر هراتی که زحمت داوری این پایانامه با ایشان بوده است، متشکرم.
پدر، مادر و همسر عزیزم، از زحمات بی دریغ و بی منت شما متشکرم.
همیشه نیازمند محبت، لطف و دعای خیر شما هستم.
فهرست مطالب صفحه
چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1
فصل اول (مقدمه و هدف) …………………………………………………………………………………………………………………..3
1-1-بیماری سل…………………………………………………………………………………………………………………………………..5
1-2- مایکو باکتریوم ها ………………………………………………………………………………………………………………………..7
1-2-1-نامگذاري…………………………………………………………………………………………………………………………………7
1-2-2- طبقه بندی مایکو باکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….9
1_2_3_ مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی ………………………………………………………………………………. 11
1-2-4- خصوصیات رشد مایکوباکتریها ……………………………………………………………………………………………….12
1-2-5- فاکتورهای ویورلانس مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………..13
1-2-6- آنتی ژنهای مایکوباکتریوم ها……………………………………………………………………………………………………14
1-3- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………..15
1-4- اشکال بیماری سل …………………………………………………………………………………………………………………….17
1-5- عوامل مساعد کننده ……………………………………………………………………………………………………………………17
1-6- عارضه های بیماری…………………………………………………………………………………………………………………….18
1-7- پیدایش بیماری ………………………………………………………………………………………………………………………….18
1-8- روشهای تشخیص ……………………………………………………………………………………………………………………..20
1-9- درمان ………………………………………………………………………………………………………………………………………21
1-10- عوارض داروهای ضد سل ……………………………………………………………………………………………………….22
1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23
1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23
1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23
1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24
1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24
1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26
1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو …………………………………………………………………………………………………27
1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27
1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29
1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30
1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30
1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35
1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36
1-15-2-2- تعيين هويت مولکولي مايکوباکتري هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39
1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39
1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39
1-15-2-2-3- روش هيبريديزاسيونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39
1-15-2-2-4-پروب هاي هيبريداسيون داخل ژنومي تجاري …………………………………………………………………40
1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40
1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42
1 _16_1_تكنيك‌هاي ژنومي كه اساس آنها PCR نمي‌باشد …………………………………………………………………..42
1_16_1_2_انگشت‌نگاري DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43
1_16_2_1_اسپوليگوتايپينگ………………………………………………………………………………………………………………50
1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP……………………………………………………………………….. 50
1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51
فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55
2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56
2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58
2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65
فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70
3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71
3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71
3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71
3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73
3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73
3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73
3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74
3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74
موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74
3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74
3_4_1_3_تفسير نتايج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76
3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76
3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78
3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79
3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80
3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80
3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81
3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82
3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82
3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82
3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83
3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83
3_4_7_2_ كنترل و جمع آوري سلولهاي باكتري رشد يافته ……………………………………………………………..83
3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84
3_4_8_ارزيابي كيفيت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86
3_4_8_1_ارزيابي كفيت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86
3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86
بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86
بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86
ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86
3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88
3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90
3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91
3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92
RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93
3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94
3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94
3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94
3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96
3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96
3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97
3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98
3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98
3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99
3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب براي پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99
3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100
3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101
3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102
3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102
3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102
فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104
نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105
4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105
4-2- بررسي كشت لوله هاي لونشتاين– جانسون ………………………………………………………………………………..105
4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106
4-3-1- نتايج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106
4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107
4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108
4-6- نتايج هضم آنزيمي(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109
4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110
فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114
پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126
منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126
منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحهجدول1-1نامگذاري مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف کندرشد مایکوباکتریای ……………. 33جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی ……………….. 35جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71جدول 3-2: ليست مواد مصرفي …………………………………………………………………………………………………………… 72جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها ………………………………………………………………………………. 81جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها ………………………….. 113
فهرست شکل ها
عنوان شکل صفحهتصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010……………………………………………………………………………………….. 6تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها ……………………………………………………………………………………………. 11تصویر1-3: عکسبرداري توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………………… 11تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ………………………………….. 13تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………… 14تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………… 16تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس …………………………………………. 20تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ……………………………………………………………. 21تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه……………………………………………………………………. 24تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس ………………………………………………………………………………… 29تصویر1-13:ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوزیس ……………………………………………………………………………………. 41تصویر1-14:ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوزيس ……………………………………………………………………………………. 41تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………….. 42تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش REA …………………….. 46تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش RFLP …………………… 46تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوزيس H37RV ……………………….. 51تصویر1-19 : لوکوس DR و يک توالي فاصله انداز را DVR ميگويند ………………………………………………… 51شکل 1-20 : حذف توالي هاي فاصله انداز، که ممکن است در يک يا چند توالي فاصله انداز باشد …………. 52تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر ……………………………………………………………………………………. 57تصویر 3-1: نمونهای از عقدههای لنفاوی …………………………………………………………………………………………. 71تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كينیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون………………. 75تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كينیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی …………….. 76تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگآمیزی فلوئوروکروم …………………………………………………………………… 81تصویر 3-5: لولههای تست نیاسین مثبت و منفی ……………………………………………………………………………….. 82تصویر 3-6- نمائی از لولههای کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ……………………………………………………….. 83تصویر3-7: دستگاه نانودراپ ………………………………………………………………………………………………………….. 88تصویر 3- 8: صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ……………………………………………………………………….. 88تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر ………………………………………………………………….. 89تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ………………………. 90تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی ………………….. 92تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینهای ………………………. 97تصویر 3-13: دات بلات PGRS و DR ………………………………………………………………………………………………………………. 102تصویر4-1- لوله هاي لونشتاين– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ……………………………….. 106تصویر4-2- الكتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 ……………………………………. 107تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه …………………………………………………………………………………… 108شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP …………………………………………………………………………… 109تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ……………………………………….. 110تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS …………………………………………………. 111تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ………………………………………………………. 112
چکیده:
بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا استفاده از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.
در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت، تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.
این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماري سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروي مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه هاي مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها براي ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماري سل درانسان ضروري است.
کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس- تعیین هویت مولکولی – RFLP PGRSDR,

فصل اول
مقدمه و کلیات
1-مقدمه:
سل یک بیماری واگیردار است. تقریبا یک سوم جمعیت جهان (یعنی 2 میلیارد نفر) به میکروب سل آلوده و در خطر ابتلا به بیماری قرار دارند و هر ساله حدود 9 میلیون نفر به سل فعال مبتلا شده و حدود 5/1 تا 2 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می سپارند. شیوع مجدد بیماری در دو دهه اخیر نشان دهنده درگیر بودن تمام کشورها با مایکوباکتریوم‌ها1 بوده است. بیش از 90 درصد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد. با جهانی شدن بیماری مهلک ایدزومساله حائز اهمیت مقاومت چند داروئی که نتیجه مدیریت ضعیف درمان سل است، سازمان بهداشت جهانی(WHO) درمجمع سال 1991 ضمن اعلام بیماری سل به عنوان یک اورژانس جهانی، کاهش هر چه سریع تر میزان شیوع مرگ و میر و به تبع آن میزان بروز سل را در اهداف کلی خود و کشورها قرار داده و سپس با معرفی راهبرد DOTS زمینه کنترل بیماری را بطور نسبی فراهم آورد. در حال حاضر با توجه به دادههای آماری سل یکی از بزرگترین علت مرگ ناشی از بیماریهای عفونی تک عاملی بوده(حتی بیش از ایدز، مالاریا و سرخک) و دارای مرتبه دهم در بار جهانی بیماری هاست و پیش بینی می شود تا سال 2020 همچنان جایگاه کنونی را حفظ کند و یا تا مرتبه هفتم بالا رود. (هاین و کریمر2، 2012).
باسیل این بیماری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یا باسیل کخ نام دارد زیرا که در سال ۱۸۸۲ (میلادی) پرفسور رابرت کخ دانشمند آلمانی آن را کشف کرد. بیماری سل گاوی یکی از قدیمی ترین بیماریهای عفونی مشترک بین انسان و دام است که قدمت آنرا به اندازه حیات بشریت می‌دانند و از گذشته‌های دور مورد شناسایی قرار گرفته است. (سینگ و ورما3، 2004).
سل گاوی که عامل آن مایکوباکتریوم بویس میباشد، یکی از اعضای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس است. این بیماری یکی از مهمترین بیماریهای عفونی خانواده بویده به ویژه گاوها و خانواده کاپرینه به ویژه بزها در سراسر دنیا از جمله ایران میباشد و سالیانه رقم قابل توجهی را برای پیگیری و ادامه برنامه ریشه‌کنی به خود اختصاص میدهد. در ایران علیرغم به کارگیری برنامه ریشه کنی سل گاوی با این که شیوع این بیماری در گاوداریهای صنعتی بشدت کاهش پیدا کرده است ولی هنوز سل گاوی در دامداری های کشور دیده می‌شود به همین منظور براي كنترل بيماري سل گاوي برنامه هاي ريشه كني و كنترل از سال 1334 مورد اجرا درآمده و نتايج نشان ميدهد كه از17 % به 14/0% كاهش يافته است. علوی (1388) برنامه هاي تست و كشتار دام هاي آلوده، ‌مسير نقل و انتقال دام ها و شناسايي منبع عفونت و تكنيك هاي مولكولي و بيوشيميايي توانسته اند با شناسايي سويه های مايكوباكتريومها از پيشرفت و شيوع ْآن جلوگيري نمايند. داوید و همکاران4 (1987) شناسايي سريع عفونت در گله هاي گاوهاي كشور براي جلوگيري از انتقال يك امر ضروري ميباشد زيرا مايكوباكتري هاي پاتوژن داراي دوره انكوباسيون طولاني مدت بوده و اين امر تشخيص آزمايشگاهي آن را با مشكل مواجه مي‌سازد. امروزه از مطالعات اپيدميولوژي سل در ارزيابي برنامه هاي كنترل بيماري، تعيين بروز و ميزان شيوع و از ژنوتايپينگ ايزوله ها و مولكولار اپيدميولوژي در قرابت و طبقه بندي سويه ها، ارتباط بين سل حيوانات مختلف و ساير فاكتور هاي دخيل در آن و همچنين رديابي منشاء عفونت استفاده هاي شاياني مي‌نمايند. لذا بكارگيري روش هاي نوين جهت تشخيص اين بيماري بسيار ضروري ميباشد. امروزه تكنيك هاي مولكولي مانند انگشت نگاري ژنومي به روش 5RFLP، براي شناسايي دقيق و متمايز نمودن ايزوله هاي مايكوباكتريوم ميباشد. داوید و همکاران(1987) پروب ها قطعه اي از ملكول هاي تك رشته اي RNAيا DNA هستند كه به روشهاي مختلف نشان دار يا ليبل ميشوند. اين پروب ها با توالي نوكلئوتيدي مكمل خود با DNAي هدف، در شرايط ويژه آزمايشگاهي هيبريد مي‌شوند. سپس نواحي هيبريد شده به طرق مختلف رديابي شده تا تفاوت سويه ها به لحاظ جايگزيني پروب در نواحي خاص كروموزم نمايان گردند. پریراز و همکاران6(2012) در اين مطالعه سعي شده است جدايه‌هاي بدست آمده باتكنيك RFLP با آنزيم PvuIIو استفاده از پروب‌هاي PGRS 7 و DR8 از نظر تنوع الگوي ژنومي مورد مقايسه قرار گيرند.
اهدف تحقیق:
از آنجائيكه در بحث كنترل منطقه اي سل و رديابي منشاء عفونت اين بيماري، به قدرت تفكيك گونه ها و سويه‌هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكسنياز ميباشد، تحقيقات اپيدميولوژي مولكولي شكل جديدي را به خودگرفته است. در همين راستا و در امر كنترل و ريشه كني بيماري سل گاوي شناسايي منابع عفونت، مسيرهاي انتقال و پيدا نمودن مخازن از چالش هاي اصلي است و تمايز سويه هاي مختلف مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكس در تمامي استان‌هاي كشور الزامي به نظر ميرسد.تکنیک‌های جدید مولکولی، برای متمایز نمودن سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از منابع مختلف و جهت بررسی‌های اپیدمیولوژی ابزارهائی کارا به شمار می آیند(می هی و همکاران9، 2011).
با وجود انجام مطالعات متعدد در مناطق مختلف ايران در ارتباط با مولكولار اپيدميولوژي اين بيماري اطلاعات چنداني در اين زمينه در استان خراسان در اختيار نبوده و بررسي شيوع مجدد بيماري سل و ارزيابي ريشه هاي انتقال در اين استان از اهميت ويژه اي برخوردار است. به همين منظور در اين تحقيق سعي بر اين است كه با استفاده از تكنيك‌هاي تايپينگ مولكولي(انگشت نگاری ژنومی مایکوباکتریوم ها) مانند RFLP(پلي مورفيسم قطعات به وسيله آنزيم هاي محدودكننده) و با بهره گیری از متمایز کننده ترین روش های توصیه شده در تحقیقات گذشته، تمايز بين سويه هاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس جدا شده از گاوهايتوبرکولین مثبت استان خراسان صورت پذيرد تابتوان از يافته‌هاي تحقيق در اهداف فوق بهره جست.
در مطالعه حاضر دو هدف دنبال ميگردد:
1- استفاده از تكنيك هاي براساس PCR همچون IS6110 در جهت تعيين هويت جدايه هاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس
2- استفاده از تكنيك DR-PGRS – RFLP در جهت بررسي ژنتيك جمعيتي جدايه هاي مورد مطالعه و تعيين ژنوتيپ هاي موجود در استان خراسان
1-1-بیماری سل:
مرض سل يا توبركلوز (TB) یکی از بیماریهای مهلک در جهان است که عامل آن مایکوباکتریوم‌ها یا به طور دقیقتر مایکوباکتریومهای سلی است. در بیماری سل معمولا ششها مورد حمله قرار می‌گیرد، این نوع سل را تی بی ریوی نیز گویند ولی از ساير اعضاي درگير در سل می‌توان سیستم عصبی مرکزی، غدد لنفاوی و گردش خون، دستگاه تناسلی وادراری، دستگاه گوارش و معده، استخوان‌ها و مفاصل و پوست رانام برد. ساير مایکوباکتریومها مانند بووی، افریکنم، میکرتی و کانتی نیز باعث بيماري می‌شوند ولی نادر هستند. از انواع نشانه‌های سل می‌توان به سرفه مزمن همراه با خلط سینه اغشته به خون، تب، تعريق شبانگاهی و کاهش وزن اشاره کرد. سل را می‌توان با راديوگرافی قفسه سینه، تست پوست و خون و بررسی میکروسکوبی وکشت میکروبی خلط و مایعات بدن درازمایشگاه تشخیص داد. درمان سل مشکل است وبه دوره‌های طولانی و استفاده از انتی بیوتیک‌های متفاوت نیاز دارد همچنین باید رفتار وتماس افراد کنترل شود. گونه هاي مقاوم به آنتي بيوتيك مايكوباكتريوم در سالهاي اخير درمان سل را با مشکل روبه رو کرده است.
تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010در هر 100000نفر. قهوه ای بیشتر از 300، بنفش=299-100، خردلی=99-50 ،نارنجی=49-25،زرد 24-1 و خاکستری صفر
پیشگیری از الوده شدن به سل وکنترل تماسهای افراد وهمچنین واکسیناسیون توسط واکسن ب ث ژ بهترین شیوه مبارزه با سل است. باکتری‌های سل می‌توانند توسط عطسه وسرفه ویا تف کردن افراد آلوده به سل در محیط پخش شوند. در حال حاضر حدود یک سوم جمعیت جهان به باکتری‌های سل نوع ضعیف آلوده‌اند وسرعت آلوده شدن افراد درحال حاضر یک نفر در هر ثانیه‌است هرچند بسیاری از این عفونت‌ها به صورت نهانی هستند. حدود یک دهم این عفونت‌ها نهايتا به سل آشكار تبدیل می‌شوند واگر بدون معالجه رها شوند بیش از نیمی از آنها به مرگ منجر می‌شود. عزیزی، فریدون (1379) در سال ۲۰۰۴ حدود 14.6 ملیون نفردر جهان از بیماری نوع شدید سل رنج می‌برند وحدود 8.9 ملیون نفردر جهان مستعد نوع شدید سل هستند وحدود1.6 ملیون نفر نیز بر اثر سل مردند. بیشتر این آمار مربوط به کشورهای جهان سوم است اما این آمار حتی در کشورهای پیشرفته نیز رشد داشته دلیل این امر می‌تواند کم کاری در زمینه واکسیناسیون و يا گسترش بيماري ایدز ‌باشد. حدود ۸۰٪ افراد سلی در آسیا و آفریقا هستند ودرآمریکا حدود ۵ تا ۱۰ درصد به آزمایش سل جواب مثبت داده‌اند. در آمریکا۲۵۰۰۰ نفر مستعد سل وجود دارد وحدود ۴۰٪ سل در آمریکا به دلیل مهاجرت افراد آسیایی و آفريقایی رخ می‌دهد.
با شروع عملیات ریشه کنی سل گاوی در ایران از سال 1337 به تدریج موارد سل گاوی کاهش یافته به طوریکه با استفاده از تست توبرکولین و کشتار گاوهای آلوده، آلودگی سل گاوی در کشور ازحدود 5% در سال1351 به 12/0 در صد در سال 1383 رسید. بدین ترتیب با کنترل بهداشتی دامداری‌ها و کشتارگاه‌ها موارد سل گاوی کاهش یافت و با پاستوریزاسیون و جوشاندن شیر، بیماری ناشی از سل گاوی در انسان به تدریج رو به نقصان گذاشت.

1-2-مایکوباکتریوم ها:
مایکوباکتریومها، ارگانیسم هاي میله اي شکل، نازك وبدون تحرك متعلق به خانواده مایکوباکتریاسهورده اکتینومیستالها وکلاس اکتینومیسه میباشند. موًید و همکاران10 (2012) نام مایکوباکتریوم به معنی باکتری قارچی است که به خصوصیت قارچ مانند باسیل سل اشاره دارد. لمیشنکو و همکاران11(2008) در حال حاضر تا ژانویه سال 2010 تعداد 158 گونه مختلف در جنس مایکوباکتریوم شناسایی شده است. آسیمو و مد12(2008) این گونه ها طیف وسیعی ازعفونتهاي موضعی تا بیماريهاي منتشر را در انسان و حیوانات ایجاد میکنند. اگرچه بعضی از گونه ها فقط درانسان عفونت ایجاد می کنند ولی سایرگونه ها ازحیوانات گوناگونی جدا شده است. همچنین گونه هاي زیادي درآب وخاك یافت میشوند. از بسیاري جهات، مایکوباکتریومها را براساس تفاوتهاي بنیادي دراپیدمیولوژي وبیماري، به دوگروه اصلی زیرتقسیم می شوند.:
1-کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم آفریکانوم، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم پینیپدي، مایکوباکتریوم کاپره، مایکوباکتریوم میکروتی، مایکوباکتریوم کانتی) که کند رشد وکلنی آنها فاقد پیگمان می باشند.
2- مایکوباکتریومهاي غیرتوبرکلوزیس(NTM)
1-2-1-نامگذاري
جنس مایکوباکتریوم یکی ازقدیمیترین جنسهایی است که مورد تعریف قرارگرفته است. نام ژنریک مایکوباکتریوم براي اولین بار به گروهی از ارگانیسم ها که برروي محیط هاي مایع به صورت لایه اي نازك شبیه کپک میروئیدند، اطلاق میگردید. لمیشنکو و همکاران (2008) درشروع قرن اخیرخصوصیاتی را که براي مایکوباکتریهاتعریف میکردند شامل نداشتن حرکت، مورفولوژي باسیلی شکل کمی خمیده ومیله اي شکل وخصوصیت مقاومت به اسید و الکل متعاقب رنگ آمیزي با فوشین فنی که (رنگ آمیزي ذیل نلسون) بود. راستوجی و همکاران13 (2001) در راسته اکتینومایستالز، مایکوباکتریوم متعلق به جنس مایکوباکتریوم بوده که تنها جنس خانواده مایکوباکتریاسه میباشد. مایکوباکتریاها، به عنوان اکتینومیستهاي هوازي، مقاوم دربرابراسید والکل، میله اي شکل وگاهاً با توانائی ایجاد شاخه بدون ایجاد هیفه هوائی، تعریف میشوند. این باکتریها غیرمتحرك وبدون هاگ بوده و دردیواره سلولی داراي آرابینوز، گالاکتوز و مزودي آمینو پیمیلیک می باشند و نسبت درصد بازهاي گوانین و سیتوزین، دراسید هسته ای شان(DNA) درحدود 62 تا 70 مول درصد می باشد(بجزمایکوباکتریوم لپره که درصد بازهاي GC آن 58 %است). مایکولیک اسیدشان داراي وزن مولکولی بالا(60تا90کربن) بدون ترکیبات با بیش از دو پیوند دوگانه غیراشباع می باشد(گوترزو همکاران14، 1995).
از قدیم این ارگانیسم ها را فاقد کپسول قلمداد میکردند لیکن درحال حاضر مایکوباکتریها را همراه با ساختمان کپسولی شکلی می شناسند(96). این ارگانیسم ها را به طور اولیه به عنوان هوازي هاي اجباري قلمداد مینمودند، ولی برخی از گونه ها وسویه ها، میکروائروفیلیک بوده و به صورت نوارباریکی در زیر سطح محیط هاي نیمه جامد رشد می نمایند. اکتینومیست ها از نقطه نظر خصوصیات اکولوژیکی ومورفولوژیکی شامل میکروارگانیسم هاي متفاوتی می باشند. دور و همکاران15 (2000) تمامی مایکوباکتریها و میکروارگانیسم هاي وابسته مثل اعضاي (کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم ونوکاردیا و گروهی که شامل جنس هاي رودوکوکوس، گوردونه و تسوکامورلا می باشد) براساس توانائی تولید مایکولیک اسید داراي وزن مولکولی بالاي اسید چربβ هیدروکسی با زنجیره بلند جانبیα متمایز می شوند. دور و همکاران (2000) اعضاي گروه کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم و نوکاردیا[CMN] تنها میکرارگانیسم هایی هستند که قادر به سنتز مایکولیک اسیدمی باشند. دور و همکاران (2000)
جدول1-1نامگذاري مایکوباکتریوم ها

1-2-2-طبقه بندی مایکوباکتریوم ها:
در گذشته نامگذاری عفونتهای مایکوباکتریایی، بدون در نظر گرفتن نوع ارگانیسم به مایکوباکتریهای سلی و مایکوباکتریهای غیرسلی(همچنین عبارت مایکوباکتری های آتیپیک یا مایکوباکتری های مجزا از گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس) محدود می‌شد. اولین تقسیم‌بندی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل سل انسانی، مایکوباکتریوم بویس مسئول سل گاوی، مایکوباکتریوم آفریکانوم16 مسبب سل انسان و اساسا محدود به آفریقا، مایکوباکتریوم میکروتی17 پاتوژن جوندگان کوچک و سویه واکسینال مایکوباکتریوم ب.ث.ژ. بود. با ظهور تکنولوژي تعیین توالی اسیدهاي نوکلئیک و ژنوتایپینگ این امکان به وجود آمده است که ارتباط بهتري در توصیف مجدد ژنوتایپینگ وفنوتایپینگ موجود، فراهم شود. این موضوع در تشخیص گونه هاي جدید هم موثر بوده است. نامگذاري باکتريها به وسیله کد بین المللی صورت گرفته ونام صحیح مربوط به طبقه باکتري بر اساس درج باکتري در منابع معتبر علمی که داراي نشر طولانی و اعتبار قانونی در مجامع علمی هستند صورت میگیرد. از اوایل ژانویه1980 نام باکتري هاي قبلی بر اساس لیست تائید شده نامگذاري باکتري انجام گرفت وهر باکتري که نام آن در لیست موجود نبود در نامگذاري قرار نمی گرفت. براساس علائم کلینیکی مهم، مایکوباکتریوم ها به3 گروه اصلی طبقه بندي میشوند:
1- شدیداً پاتوژن، ازجمله پاتوژنهاي انسانی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم لپره و پاتوژنهاي حیوانی شامل مایکوباکتریوم بویس، که قادرند به بافت های طبیعی حمله و بیماری فعال و پیشرونده ایجاد کنند.
2- پاتوژنهاي فرصت طلب یا) پاتوژنهاي بالقوه ( شامل مایکوباکتریوم سیمیه18،مایکوباکتریوم آویوم19 ومایکوباکتریوم گزنوپی که به طور طبیعی و آزادانه در محیط زندگی می کنند و بصورت فرصت طلب باعث بیماری در انسان و حیوانات می شوند.
3- ندرتاً پاتوژن شامل ساپروفیت هایی مانند مایکوباکتریوم فله اي20و مایکوباکتریوم اسم گماتیس21در میان مایکوباکتریوم ها عبارت22 (MAIS)قبلا به گروهی از مایکوباکتریوم هاي کند رشد که شامل کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم اینتراسلولار23، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم24می باشد، اطلاق می شد که از نظر خصوصیات ظاهري به هم شبیه و در برخی مواقع تفریق آنها از یکدیگر مشکل بود. راستوجی (1992) امروزه واژه MAIS کاربرد چندانی ندارد به طوری که با استفاده از تکنیک هائی مانند هیبریدیزاسیون اسید هسته اي25، آنالیز آنتی ژنی وتوانایی ارگانیسم در هیدرولیز اوره، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم به راحتی از مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار قابل تفکیک است. واژه دیگري که بسیار کاربرد دارد، کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم(MAC) است که در برگیرنده دوگونه مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار می باشد که قبلا از سه تحت گونه مجزا به نامهاي مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه آویوم، مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه سیلواتیکم تشکیل می شد( آرونی تانگ وان و همکاران26، 2010).
در بین گروه مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس به جهت نیاز به مایکوباکتین در محیط کشت از بقیه به راحتی قابل تفریق است (میانگین تقسیم آن 48ساعت و مدت زمان رشد حدود 16هفته). همچنین گاهی اوقات مایکوباکتریوم ها را به دو گروه می شناسند، یک گروه به نام کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم آفریکانوم، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم میکروتی وگونه هاي که جدیداً شرح داده شده بنام مایکوباکتریوم کانتی، مایکوباکتریوم پینیپدي)می باشد وگروه دیگر مایکوباکتریهاي غیراز کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MOTT)27بوده و عبارت مایکوباکتریهاي “غیرسلی” یا “آتیپیک” مترادف با MOTTاست (ام سی لرنون و همکاران، 2010).
معمولا ًونه الزاماً مایکوباکتریوم هاي فرصت طلب، پاتوژنهائی کند رشد با میانگین تقسیم12-24ساعت بوده ومیانگین لازم براي رشد آنها در محیط کشت اختصاصی حدود 15تا28 روزاست. البته این در مورد مایکوباکتریوم لپره28استثنا میباشد زیرا این باکتري توانائی رشد بر روي محیط مصنوعی را نداشته و تکثیر آن درحیوانات آزمایشگاهی بین 7 تا 14روزبطول می انجامد. سازمان بهداشت حیوانات29 (2009) درمقابل بسیاري ازپاتوژن هاي نادر یا گونه هاي دیگر مایکوباکتریوم هاي ساپروفیت هم وجود دارند که داراي رشد سریعی بوده و متوسط تقسیم آنها بین 2 تا 6 ساعت متغیراست و زمان لازم براي رشد روي محیط کشت، درمورد باکتري هاي اخیر 1تا 7 روزاست. (سازمان بهداشت حیوانات 2009)
1_2_3_مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی:
تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها
مایکوباکتریوم ها ارگانیسم های میله ای شکل باریک، کمی خمیده یا مستقیم به طول 10-2 میکرون و عرض 4/0_2/0 میکرون هستند که با ظاهری دانه دانه به رنگ قرمز درخشان در زمینه آبی دیده می شوند. مطالعه با ميکروسکوپ الکتروني نشان مي دهد که مايکوباکتريوم ها پروکاريوت هستند و مواد هسته، از جمله DNA، به وسيله غشا از سيتوپلاسم جدا نيستند. شکل آنها به وسيله يک ديواره ضخيم و محکم شامل دو لايه حاجب – الکترون که به وسيله لايه کم تراکم ديگري از يکديگر جدا شده اند حفظ مي شود و حذف ديواره سلولي به کمک مواد شيميايي، شکل ميله اي آنها را به صورت ساختمان کروي يا اسفروپلاست تغيير مي دهد (علوی، 1388).

تصویر1-3: عکسبرداري توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
ضخامت ديواره سلولي حدود 100 تا 200 آنگستروم است. زير ديواره سلولي، غشاي سيتوپلاسمي وجود دارد که شامل دو لايه به قطر 30 آنگستروم است و يک لايه کم تراکم به قطر 3 آنگستروم و در وسط آنها قرار دارد. در سلول در حال تقسيم اين ديواره سيتوپلاسمي به طرف داخل پيشرفت مي کند تا تقسيم سلولي کامل شود. مطالعات مختلف در مراحل متفاوت رشد مايکوباکتريوم ها ، وجود ذرات کوچکي به اندازه تقريبي 120×80 آنگستروم را در سيتوپلاسم نشان مي دهد که ريبوزوم ناميده مي شوند و تعداد آنها از ابتداي مرحله لگاريتمي رشد تا مراحل آخر لگاريتمي افزايش مي يابد. اين ذرات با رشته هايي به قطر حدود 7 آنگستروم به يکديگر متصل مي شوند و پلي ريبوزوم را تشکيل مي دهند.
هسته مايکوباکتريوم ها شامل رشته هايي است که احتمالا يک مولکول DNA مارپيچي درازبه طول 30 آنگستروم مي باشد. به نظر ميرسد که مايکوباکتري ها، ارگانيسم هاي يک هسته اي هستند. بررسي هاي بيوشيمايي نشان مي دهد که DNA مايکوباکتريوم ها يک مولکول دو رشته اي حاوي مقادير زياد گوانين و سيتوزين است و وزن مولکولي آن در حدود 109× 6/4-5/2 دالتون بر آورد شده است (پالومین، 2007; سزاوار30، 2008).
1-2-4-خصوصیات رشد مایکوباکتریها
برخلاف سایر باکتريهاي بیماريزا که بیهوازي یا هوازي اختیاري هستند، باسیل سل هوازي اجباري است و میتواند در محیطهاي کشت مصنوعی ساده حاوي گلیسرین به عنوان منبع کربن و املاح آمونیوم به عنوان منبع ازت رشد کند. آسپاراژین یا مخلوطی از اسیدهاي آمینه معمولا به محیط کشت افزوده میگردند تا شروع رشد را تسهیل و سرعت آنرا بهبود بخشند. اگرچه مایکوباکتریوم ها به اثر مهارکننده مواد چربی در محیط کشت خیلی حساسند ولی مقادیر اندك اسیدهاي چرب با زنجیر طویل موجب تحریک آنها میشوند.pH مناسب رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حدود6 تا 8 وpH متوسط آن5/6-6است. اختصاصات رشد برحسب سویه باسیل، محیط رشد و غیره متفاوت است. رشد باسیل سل در محیط هاي کشت جامد، مثل محیط تخم مرغ، انبوه وفراوان است و پرگنه ها برجسته، زبر با ظاهري گل کلمی یا مخروطی نامنظم، خشک وشکننده می باشد (تصویر1-4). سرعت رشد باسیل سل چه در محیط کشت و چه دربدن حیوانات کند است ولی بعضی از مایکوباکتریوم هاي ساپروفیت رشد سریعتري دارند وبه طور کلی سرعت رشد مایکوباکتریومها خیلی آهسته تراز سایرباکتريها است(کول31، 2002).
تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون
1-2-4-فاکتورهای ویرولانس:
ديواره سلولي مايكو باكتريومها از نظر ساختمان شيميائي تركيبي از پپتيدو گليكان، آرابينو گالاكتان و اسيد مايكـوليك و همــچنين ليپيدهائي همــانند مايكوزيدهـا، Cord Factor و سـولفاليپيدها بوده كه اين اجـــزاء ديـــواره سلولــي در پاتوژنز باسيلهاي سلــي نقــش دارند. ( با اينكه پاتوژنيسيته مايـكوباكتريوم توبركولوزيس بوجــود فاكتورهــاي گوناگون ليپيدي وابسته است اما تا به امروز مكانيسمي كه تــوسط آن باسيلهـاي سلي از فعاليت ليتيك فاگو سيتوز فرار مي كنند، شناخته نشده است . ) پپتيدو گليكان كه اسكلت ديواره سلولــي را شكل مي دهــد شامــل اسيدN گليسرول موراميك وN استيل گلوكز آمين ( اتصال يافته بوسيله اسيدهاي آمينه ) ميباشد. اين ساختمــان شبكه مانند ( پپتيدوگليكان ) بوسيله آنزيم ليززوزيم شكافته شده و در بيشتر ترشحــات ميزبان حضـــور پيدا ميكند و در نهايت دي پپتيـــد موراميل ( M D P ) توليد شده، كه فعاليت ايمونولوژيك قوي دارد . ميزان جزء ليپيدي مايكو باكترياها بالا است و احتمالاً در حدت و ايجاد واكنــش ايمونولوژيك در برابر آلودگي نقشي مستقيم بعهــده دارند. راستوجی(1992) البته بعلت پيچيــدگي هــاي اين ليپيــدها هنــوز مفهومــي درست از نقش و ساختمــان آنها بدست نيامده است. خاصيت هيدروفوبيسيتي( آبگريزي ) ليپيدهاي موجود در ديواره سلولي ممكـن است نقشي مهم را در مقاومت دهيدراتاسيون و بقاء ارگانيسم در شرايط نامســاعد ايفاء نمايد. ليپيدهاي مايكوباكتريال شامل اسيدهاي مايكوليك، گليكوليپيدها و واريته هاي ديگر ميباشد. اسيدهاي مايكوليك از اسيدهــاي چرب منشـعب شده و در مايكــو باكتريوم، نوكارديا و كورينه باكتريوم يافت ميشوند. اما وجــود اختلافــات عمده اي كه در الگـــوهاي اين ليپيدها وجود دارد امكان ايجاد يك سيستم تشخيصي( بیشتر براي مايكو باكتريها ) را بر اساس آناليز ليپيدها بوسيله تكنيك كروماتوگرافي لايه نازك فراهم آورده است.
تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها
گليكو ليپيدهاي مايكوباكتريومها خصوصاً سولفاليپيدها احتمالاً با حدت باكتري ارتباط داشته اما اين ارتباط، رابطه اي ساده نيست. ممكن است سولفاليپيد ها مانع از تشـكيل ليزوزوم فاگوزوم شده و يا از ليز باكتــــري در فاگوسيتها ممانعت كننــد. راستوجی(1992) سولفــاليپيدي بنامCord Factor و۶ دي مايكول ترهالوز از مايكو باكتريوم بوويس و مايكو باكتريوم توبركولوزيس حدت دار جدا شده و اعتقاد بر اين است كه بطور عمــده بعنوان فاكـتور حدت بوده زيرا بروشني داراي خــواص توكسـيك مي باشد اما عاملـي مهم در ايجاد بيماري نمي باشد. از ساير ليپيدها ميتوان موم D هتروژنوس را نام برد كه در مايكو باكتريوم توبركولوزيس شامل پپتيدو گليكــان بوده اما در مايكو باكتريوم بوويس پپتيدو گليكان كمتري داشته و بيشتر محتوي ليپو پلي ساكاريد است. فعــاليت قوي موم D مربوط به حضـــور دي پپتيد موراميل بوده و توانائي ايجاد گرانولوماس را نيز دارد.
1-2-6-آنتي ژنهاي مايكو باكتريوم ها :
محدوده وسيعــي از فراكشـنهاي ( Fractions ) مايكوباكترياهــا ميتـوانند واكنشهاي ايمني همورال و وابسته به سلول را ايجاد كنند. فراورده هاي آنتي ژنيـك ( كه معمـولاً بصـورت محلول مي باشند) شامــل آنتي ژنهاي سيتوپلاسمـي يا ذره اي هسـتند. استانفورد ( Stanford ) بر اســاس مطالعات خود بر روي آنتي ژنهاي محلول ( با استفاده از تكـنيك ايمنو ديفو زيون ) آنها را به چهــار گروه عمده تقسيم نموده است :
گروه۱:آنتي ژنهائي كه بطور معمول در همه گونه هاي مايكوباكتريوم وجود دارند .
گروه ۲:آنتي ژنهائي كه محدود به مايكوباكتريوم با رشد آهسته ميباشند .
گروه ۳:آنتي ژنهاي موجود در مايكوباكتريوم با رشد سريع و نوكارديا .
گروه ۴:آنتي ژنهاي ويژه در گونه هاي معين
نشان داده شده است كه آرابينو گالاكتان در باسيلهاي سلـي، در ساير مايكــوباكتريومها، كورينه باكتريوم و نوكارديا حضور داشـته و يكـي از آنتي ژنهاي مشترك محسوب ميشود و پپتيدوگليكان ( C – مايكوزيدها ) فقط در كلني هاي صاف مايكو باكتريا وجود دارند.
1-3-پاتوژنز:
بيماري سل در بدن در طي دو مرحله انتشار مي يابد كه شامل كمپلكس اوليه و انشار بعدي ميباشد. كمپلكـس اوليه شامل ايجـاد جراحت در نقطه ورود ميكروب و همچنين در عقـده لنفاوي موضع مي باشد. معمولاً وقتي ميكروب از راه تنفسي وارد ميشود ايجاد جراحت در نقطه ورود معمـول است. و هنگامي كه راه ورود ميكروب گوارشي باشد در اينصـورت ايجاد جراحت در محل ورود ميكـروب امري غير معمـول است. اگر چه ممكن است جراحاتي در لوزه و دستگاه گوارش بوجود آيد. در بيشتر مـوارد فقط جراحات قابل مشـاهده در عقـده لنفاوي مزانتريك يا صـفاقي معمــول است. پس از گذشت زمــان ۸ روز از ورود باكـتري، كانون اوليه قابل مشاهده بوجـود مــي آيد. كلسيفيكاسيون جراحات در حدود دو هفته بعـد آغاز ميشود. بزودي كانون نكروتيك پيشرفته بوسيله لنفوسيتها احاطه شده و بدين ترتيب دانه سلـي مشخص شكل مي گــيرد . باكتري از كانون اوليه ( كه در نود تا نود و پنج درصــد موارد در گاو دستگاه تنفسي است ) به عقده لنفاوي ناحيه عبور ميكند كه سبب ايجاد جراحتي مشابه در عقده لنفي ميگردد.
تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
انتشار بعدي از كمپلكس اوليه ممكن است سل ارزني حاد را تشكيل داده و بدين ترتيب موجب ايجاد جراحات ندولار مجزا در اندامهاي مختلف بدن گرديده و يا ممكــن است موجب بروز سل مزمن در اعضاء بدن شود. در حالت اخير ممكن است در گيري عقده لنفي ناحيه اتفاق نيافتد. بر حسب محلي كه آلودگـي موضعي مي شود علائم باليني نيز متفاوت بوده اما هميشه بيمـاري بصورت پيشرونده مي باشد. البته همواره حالت توكسمـي پايدار بوجـود آمده و سبب ضعف تدريجي و لاغري و بالا خره مرگ مي گـردد.
1-4-اشکال بیماری سل
• سل ریوی که اگر ریه‌ها را درگیرکند بیماری سل ریوی حادث می‌شود که خود شامل دو



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید